恩度對腫瘤上清液誘導的血管內皮細胞遷移、成管能力及MMP-2、MMP-9活性的影響.pdf

1、前言：
　　 血管生成對于胚胎發(fā)育和所有生后組織的生長及修復來說都是至關重要的。血管生成是一個包含基底膜降解、內皮細胞粘附性降低、內皮細胞增殖并向周圍基質遷移、內皮細胞再粘附組成新的毛細血管腔的復雜的多階段過程。
　　 20世紀70年代早期有人提出了腫瘤相關性血管生成的概念。實驗表明如果沒有新生血管,腫瘤最多只能長到2-3mm3。血管生成是癌癥進展過程中的關鍵性一步。因此推測,可通過抑制血管內皮細胞的遷移和成管能力來抑制

2、腫瘤血管生成,從而抑制腫瘤的生長。
　　 基質金屬蛋白酶(MMPs)是高度保守的依賴于鋅離子的內切蛋白水解酶家族,能夠選擇性消化細胞外基質和非基質蛋白。Ⅳ型膠原是細胞外基質和基底膜的主要結構蛋白,Ⅳ型膠原酶MMP-2、MMP-9是降解Ⅳ型膠原最主要的酶,在血管生成早期的血管基底膜的降解中起重要作用。因此抑制MMP-2和MMP-9的活性可以有效防止血管基底膜的降解,減少腫瘤血管生成。
　　 出生后的血管生成是血管生成刺激因

3、子和抑制因子共同作用的平衡結果,一旦失衡可以導致炎癥、腫瘤、缺血和免疫異常等疾病[1]。抑制因子中包含一種被稱為內皮抑素的物質。自然條件下,內皮抑素的生成量很低。而人工合成的內皮抑素臨床療效又不理想。恩度(Endostar)是一種新型的重組人血管內皮抑素,理論上能有效抑制腫瘤中的血管生成,阻斷腫瘤細胞營養(yǎng)和氧氣的供應,最終使腫瘤細胞因缺乏營養(yǎng)供給而死亡。因此推測,恩度作為一種新型的血管生成抑制劑具有廣譜的抗血管源性蛋白質的功能,同時恩度

4、作為血管生成的直接抑制劑有以下優(yōu)點:血管內皮細胞對其幾乎沒有耐藥性,可以長期使用而不會引起腫瘤復發(fā)[2,3],臨床研究發(fā)現(xiàn)恩度單藥應用也具有一定的抗腫瘤作用,且安全性好[4,5]。但是其能否特異性地作用于腫瘤微環(huán)境下的血管內皮細胞,抑制其遷移、形成新的血管,從而抑制腫瘤的生長尚有待進一步研究。
　　 實驗方法：
　　 一、細胞培養(yǎng)及實驗分組
　　 將HUVEC置于含有10％FBS的DMEM培養(yǎng)液中,在37℃、5％

5、CO2培養(yǎng)箱(FORMA)中培養(yǎng),用0.125％胰酶(含0.02％EDTA)消化、傳代。在細胞培養(yǎng)及恩度干預后,在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。實驗分組為恩度濃度分別為0μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml,作用于HUVEC24小時。
　　 二、Transwell小室檢測HUVEC的遷移能力
　　 配制HUVEC懸液,調整細胞密度為1×106個/ml。將10μl細胞懸液加入Transwell遷

6、移系統(tǒng)的上層小室中,再將上層小室放入含有10％腫瘤上清液和濃度分別為0μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml恩度的培養(yǎng)孔中,37℃孵育24 h。PBS洗滌細胞3次,4％甲醛固定30 min,PBS再洗細胞3次,姬姆薩染色。用棉棒仔細去除上層小室側的未遷移細胞,觀察已穿過遷移杯8μm孔到達遷移杯底下面的細胞。顯微鏡下隨機選取5個視野進行拍攝,計數(shù)每個視野的平均細胞數(shù)量。三、Matrigel檢測HuVEC的成管能力

7、
　　 將HUVEC接種于24孔板,每孔約1×106個,培養(yǎng)24小時,棄上清液,加入含有10％腫瘤上清液和濃度分別為0μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml恩度的培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)24小時。將細胞用胰酶消化吹打,制成細胞懸液。將Matrigel涂于另一24孔板,每孔5μl,涂勻后培養(yǎng)箱內靜置30分鐘,待膠凝固,將細胞懸液接種于涂有Matrigel的24孔板內,繼續(xù)培養(yǎng)24小時。在倒置顯微鏡下觀察管腔形成情

8、況,每孔隨機選取5個視野計數(shù)管腔數(shù)目,并取平均值。
　　 四、明膠酶譜實驗測定HUVEC中MMP-2、MMP-9的活性
　　 取對數(shù)生長期細胞,用DMEM培養(yǎng)液調整細胞密度為2×105/ml,接種于24孔板,培養(yǎng)24h后離心去上清液,加入含有10％腫瘤上清液和濃度分別為0μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml的恩度,孵育24h后收取上清液。用Lowry's法測定上清液中的蛋白濃度,電泳前將樣本總

9、蛋白量調整至70μg/μl,再按5:1與上樣緩沖液混合孵育30min,上樣于含0.8g/L聚丙烯酰胺凝膠中。作SDS-PAGE,初始電壓為80V電泳30min,待溴酚藍達分離膠后加至150V電泳70-80min。電泳所得凝膠依次洗脫(40分鐘,兩次),漂洗(20分鐘,兩次),孵育(48小時,37℃),用考馬斯亮藍染色4h,再脫色。凝膠圖像掃描入計算機后即可對其條帶進行半定量分析。
　　 五、統(tǒng)計學分析
　　 實驗數(shù)據(jù)采用

10、SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行單因素方差分析和t檢驗,P＜0.05有統(tǒng)計學意義。
　　 實驗結果
　　 一、恩度對HUVEC遷移能力的影響
　　 Transwell小室檢測顯示,不同濃度恩度作用24小時對腫瘤上清液誘導的HUVEC的遷移能力有抑制作用,并呈劑量依賴性。
　　 二、恩度對HUVEC成管能力的影響
　　 不同濃度恩度作用于腫瘤上清液誘導的HUVEC24小時,可明顯減少HUVEC形成的

11、管腔數(shù)目,并呈劑量依賴性。
　　 三、恩度對HUVEC中MMP-2、MMP-9活性的影響
　　 明膠酶譜實驗顯示,不同濃度恩度作用于腫瘤上清液誘導的HUVEC24小時后,MMP-2和MMP-9的活性較對照組減弱。
　　 結論：
　　 1、恩度可抑制體外培養(yǎng)的腫瘤上清液誘導的人臍靜脈內皮細胞的遷移,使人臍靜脈內皮細胞的遷移能力降低。
　　 2、恩度可以抑制體外培養(yǎng)的腫瘤上清液誘導的人臍靜脈內皮細胞的