同型半胱氨酸對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞PAI-1及其mRNA的影響及金屬硫蛋白的拮抗作用.pdf

1、金屬硫蛋白(metallothionein,MT)是一類低分子量富含半胱氨酸的內(nèi)源性小分子量蛋白,具有清除自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的功能,是目前所知體內(nèi)最強(qiáng)的羥自由基清除劑.MT作為一種內(nèi)源性細(xì)胞保護(hù)物質(zhì)在心肌缺血一再灌注中所起的作用近年來(lái)被報(bào)道并引起高度關(guān)注.但MT對(duì)Hcy所致的內(nèi)皮纖溶活性降低是否具有逆轉(zhuǎn)作用尚不清楚.該實(shí)驗(yàn)觀察Hcy對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbilical vein endothelial cells,HUV

2、ECs)的損傷作用(PAI-1及其mRNA表達(dá)升高)及MT對(duì)Hcy損傷的拮抗作用.以探討Hcy對(duì)HUVECs PAI-1及其mRNA表達(dá)的影響;比較Hcy 1.0 mmol/L組與Hcy 1.0 mmol/L加不同濃度的MT共同孵育組分別刺激HUVECs后PAI-1及其mRNA表達(dá)的差異,為HHcy的預(yù)防和治療提供理論依據(jù).該實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)HUVECs.實(shí)驗(yàn)采用6~10代細(xì)胞,將HUVECs種于96孔培養(yǎng)板,種植密度為1×10<'4>cell

3、s/孔,培養(yǎng)于含15﹪胎牛血清(fetal calfserum,FCS)的DMEM培養(yǎng)基中,細(xì)胞生長(zhǎng)至基本融合,換無(wú)血清培養(yǎng)液孵育24小時(shí)后按以下分組方法加入不同的藥物孵育6小時(shí),收集培養(yǎng)液和內(nèi)皮細(xì)胞,分別進(jìn)行不同實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)分兩部進(jìn)行:第一部觀察Hcy對(duì)HUVECs分泌的PAI-1活性(n=8)及其mRNA表達(dá)(n=5)的影響,實(shí)驗(yàn)分4組:①對(duì)照組(C組):純培養(yǎng)液,其中不加任何試劑;②Hcy低濃度組:培養(yǎng)液中加入Hcy 0.1 mmo

4、l/L;③Hcy中濃度組:培養(yǎng)液中加入Hcy 0.5 mmol/L;④Hcy高濃度組:培養(yǎng)液中加入Hcy 1.0mmol/L.第二部分觀察MT對(duì)Hcy致HUVECsPAI-1活性(n=8)及其mRNA表達(dá)(n=5)增高的拮抗作用,實(shí)驗(yàn)共分5組:①Hcy組:培養(yǎng)液中加入Hcy(1.0mmol/L);②Hcy+MT<,1>組:培養(yǎng)液中加入Hcy(1.0mmol/L)和MT(1×10<'-6>mmol/L);③Hcy+MT<,2>組:培養(yǎng)液中

5、加入Hcy(1.0mol/L)和MT(5×10<'-6>mmol/L);④Hcy+MT<,3>組:培養(yǎng)液中加入Hcy(1.0mmol/L)和MT(1×10<'-5> mmol/L);⑤Hcy+MT<,4>組:培養(yǎng)液中加入Hcy(1.0mmol/L)和MT(5×10<'-5> mmol/L);以上各組均孵育6小時(shí).實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,收集細(xì)胞和培養(yǎng)液.將上清液移入新的96孔板中,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)用PAI-1發(fā)色底物法檢測(cè)各孔上清液中PAI-1的活

6、性;用RT-PCR技術(shù)分別檢測(cè)各組HUVECs PAI-1 mRNA的表達(dá).說(shuō)明MT可拮抗Hcy損傷HUVECs致PAI-1生成及其mRNA表達(dá)增多的作用.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:①PAI-1及其mRNA在正常情況下表達(dá)較少;②Hcy(0.1~1.0mmol/L)可促進(jìn)HUVECs PAI-1及其mRNA的表達(dá),且呈劑量依賴性,這可能是Hcy致內(nèi)皮功能紊亂的一個(gè)重要機(jī)制;③MT可有效抑制HUVECs PAI-1及其mRNA的表達(dá),亦與劑量明顯相關(guān)