RNA-SEQ BASED TRANSCRIPTOME ANALYSIS OF A HIGHLY RESISTANT AND VIRULENT METHICILLIn-RESISTANT STAPHYLOCOCCUS AUREUS.pdf

1、金黃色葡萄球菌是一種感染人和動物的重要的食源性機會致病菌，它可以引起菌血癥，肺炎和軟組織感染，引起很高的發(fā)病率和死亡率，給健康帶來嚴重的威脅。金黃色葡萄球菌具有廣泛的宿主包括人，家畜，禽類，寵物和野生動物。傳染性的病原菌可以通過動物源性食品傳播擴散，給公眾健康造成威脅。動物源性的金黃色葡萄球菌對大多數β-內酰胺類藥物均不敏感，在此基礎之上出現并擴散的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌是目前最主要的問題。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌在持續(xù)不斷地進化，對

2、好幾種抗生素的耐藥性也在不斷增加，導致了臨床上抗生素治療的失敗。耐藥菌含有許多可移動的遺傳元件，這些遺傳元件確保細菌在不斷變化的環(huán)境中通過水平基因的轉移來進化。一些調控基因控制著各種耐藥和毒力因子的表達，且理解其調控機制是非常重要的。針對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)菌株在動物及動物源性食品產品的普及率的研究已經展開，但關于其毒力和相關基因表達譜的數據還是有限的。所以，本研究目的在于通過轉錄組分析的方法尋找高毒力和高耐藥的菌株，并

3、對其耐藥與毒力機制進行研究。
　　在第一項研究中，MRSA和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌動物毒力株通過體外瓊脂稀釋法，生物膜形成，粘附，侵襲和細胞內生存性分析檢驗。此外，這些菌株的致病性進行了在小鼠金黃色葡萄球菌敗血癥模型的檢查。MRSA1679a是從雞中分離出的菌株，觀察得出它是非常致命的，在細胞培養(yǎng)和小鼠模型中具有廣泛的耐藥性。
　　第二項研究中，為了鑒定可能參與毒力和多重耐藥性的相關基因，我們對高毒力動物傳染性的耐甲氧西

4、林分離株和人類參考菌株(ATCC29313)進行了基于Illumina公司的轉錄組測序，測序得到了許多差異基因并對其進行了定量RT-PCR分析。在測序結果中，毒力因子如粘附因子和囊蛋白的表達高度上調，而那些毒素和胞外酶的表達下調。生物膜相關的基因在耐甲氧西林金黃色葡萄球菌菌株中高度表達。毒力的關鍵調控因子如sarA和kdpDE的表達也有所上調，并且，它們似乎在抑制外毒素，誘導粘附和細胞壁蛋白產生強生物膜中發(fā)揮著重要的作用。除了耐藥基因如

5、blaZ，ermC和femA，vraS和多藥ABC，轉運基因的上調也導致了實驗菌株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的多重耐藥。細菌對氟喹諾酮類的耐藥主要因為gyrA和parC基因的突變。除了幾個與應激相關的基因，許多碳水化合物代謝基因的表達量也很高，這反映了細菌對環(huán)境變化的反應。許多可移動的遺傳元件也有差異表達，并且對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的耐藥和毒力有一定的調控作用。
　　我們對MRSA1679a和ATCC29213的轉錄組對比分析結

6、果表明金黃色葡萄球菌中許多毒力與耐藥決定因子受到復雜的網絡調控。這些因子的表達根據調控網絡的環(huán)境條件而改變，其中SarA是最重要的一個調控因子，它增加了細菌的致病性，并且確保細菌能在不同的環(huán)境中生存。此外，可移動的遺傳元件也影響許多基因的表達，并最終影響金黃色葡萄球菌的表型特征。基于我們第一個研究，第二個轉錄組研究的目的是通過全基因表達分析了解高毒力和耐藥菌株MRSA1679a在亞抑菌濃度（1/2頭孢喹肟MIC）下的響應。
　　頭

7、孢喹肟是第四代頭孢菌素，特別為獸醫(yī)學而研制。世界各地的很多國家已經注冊并用于許多疾病的治療，如呼吸道疾病，牛腳腐病和急性乳腺炎，小牛敗血癥，馬呼吸道病和小馬敗血癥等。由于MRSA耐頭孢喹肟機制還需要深入探究，我們設計了這個檢測分析頭孢喹肟對MRSA1679a轉錄的影響的實驗。實驗中家禽菌株用頭孢喹肟亞抑菌濃度處理后，再與原始野生菌株比較它們的轉錄組變化。轉錄組分析結果表明，外排泵（QacA、NorB、Bcr、ABCb）在MRSA1679

8、a中上調，才表現出頭孢喹肟的耐藥特性。為了抵抗這種β-內酰胺類抗生素，青霉素結合蛋白表現出過度表達。MRSA的粘附和生物膜形成能力出現增強，以便于應激基因的過度表達。同時碳水化合物的代謝、分泌和轉運活性也有顯著增加。作為一個整體，細菌的基因組合力克服由頭孢喹肟帶來的逆境，在充滿挑戰(zhàn)的生存環(huán)境中表現出了極大的遺傳潛力。因此，這項研究讓我們深刻認識到MRSA1679a成為重要病原體的潛力以及MRSA耐頭孢喹肟的模式。當然進一步系統(tǒng)地通過分子