鎘誘發(fā)子癇前期及其干擾胎盤糖皮質(zhì)激素分泌的研究.pdf

1、實驗背景：
　　子癇前期(Preeclampsia，PE)是以高血壓、蛋白尿為主要表現(xiàn)的妊娠期特有的疾病，和患者的經(jīng)濟地位、心理、營養(yǎng)狀態(tài)、環(huán)境與遺傳因素相關(guān)。子癇前期嚴(yán)重影響母兒健康，是圍產(chǎn)期造成孕產(chǎn)婦和圍生兒死亡的主要原因之一，且目前沒有特別有效的防治方法。子癇前期其病因不明，子癇前期的孕婦分娩后相關(guān)癥狀迅速消失，提示胎盤系子癇前期發(fā)生的重要“基地”。
　　鎘（Cadmium，Cd）是一種非常重要的工業(yè)、環(huán)境毒物，具有內(nèi)

2、分泌干擾物的特性。鎘可以通過增加氧化應(yīng)激，影響內(nèi)皮細胞功能，促進炎癥反應(yīng)等各種作用引起血壓升高。胎盤是鎘毒性的一個重要的靶器官，但是并不容易穿過胎盤到達胎兒，該金屬在胎盤中高濃度聚集。胎盤是個臨時的內(nèi)分泌器官，所以本研究通過鎘對胎盤內(nèi)分泌功能特別是皮質(zhì)激素分泌與調(diào)節(jié)的干擾，了解鎘與子癇前期的關(guān)系以及它在子癇前期發(fā)病方面的特殊的毒理作用。
　　實驗?zāi)康模?br>　　采用不同劑量鎘給孕鼠腹腔注射，通過鎘中毒孕鼠血壓、蛋白尿等指標(biāo)的檢測

3、和胎盤、腎等各臟器的病理學(xué)檢查，以及鎘對胎鼠生長發(fā)育的影響，了解鎘對孕鼠的生殖毒性。臨床研究比較鎘在子癇前期及正常妊娠母血及臍血的濃度的差異。從組織，細胞和分子水平系統(tǒng)探討鎘通過促進胎盤皮質(zhì)激素合成誘發(fā)子癇前期和胎兒宮內(nèi)生長遲緩(Fetal growth restriction，F(xiàn)GR)的關(guān)系，及其作用與調(diào)節(jié)機制，為鎘對孕期胎盤內(nèi)分泌干擾毒性提供理論基礎(chǔ)。
　　實驗方法：
　　第一部分:鎘與子癇前期發(fā)生的研究
　　體內(nèi)

4、實驗:SD大鼠孕4天至19天腹腔注射不同濃度的氯化鎘(0，0.25，0.5mgCd2十/kg/d)，用BP-98A血壓儀測量大鼠血壓的變化，BCA蛋白分析試劑盒檢測蛋白尿改變，測量了解胎鼠的生長發(fā)育情況。HE染色法觀察胎盤、腎臟。肝臟、腦的病理變化，并用透射電鏡觀察胎盤滋養(yǎng)細胞的超微結(jié)構(gòu)。
　　臨床研究:收集子癇前期臨床病例，并按是否合并FGR分組。用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)測量母血以及胎兒臍血中的鎘濃度，與正常妊娠

5、婦女對照，并同時測量血中其他微量元素如:鎂、鈣、鐵、鋅的濃度。
　　第二部分:鎘對胎盤皮質(zhì)激素合成的影響和調(diào)節(jié)機制
　　體內(nèi)實驗:動物分組及染毒同第一部分，用敏感的ELISA法測定孕鼠血、胎盤及胎兒血中皮質(zhì)酮、孕酮的濃度。用RT-PCR法測量胎盤組織中的皮質(zhì)激素合成通路StAR、CYP11A1、3β-HSD2、CYP21、CYP11B1基因的表達，免疫組化法測量CYP11B1蛋白在胎盤的定位和表達，并測量糖皮質(zhì)激素局部主要調(diào)

6、節(jié)因子11β-HSD、糖皮質(zhì)激素受體的基因及蛋白的表達。
　　體外實驗:鎘對JEG-3細胞進行染毒，染毒劑量分別為0（對照組）、0.25、0.50、1.00μM。染毒結(jié)束后MTT法檢測細胞相對活力，用ELISA法測定培養(yǎng)基中皮質(zhì)醇和孕酮分泌水平。RT-PCR法和Western blot法測量鎘刺激后皮質(zhì)醇合成的關(guān)鍵酶CYP11A1、CYP11B1基因及蛋白水平的表達。培養(yǎng)液中分別依次加入孕酮為底物和甲吡酮作為拮抗劑，了解鎘作用于皮

7、質(zhì)激素合成酶的途徑。在培養(yǎng)液分別依次加入ACTH和8-溴-cAMP，了解局部皮質(zhì)激素合成的調(diào)節(jié)機制。RT-PCR法和Western blot法測量染鎘后滋養(yǎng)細胞11β-HSD2和糖皮質(zhì)激素受體的表達變化。
　　實驗結(jié)果：
　　1.鎘誘導(dǎo)大鼠的子癇前期臨床癥狀
　　用0.5mg/kg/d劑量鎘的大鼠于孕10-13天血壓逐漸升高，高于對照組及非孕同等劑量組(p＜0.01);24小時蛋白尿水平也高于對照組及非孕組(p＜0.0

8、1);胎鼠平均出生體重低于對照組(p＜0.05)。
　　2.鎘誘導(dǎo)的子癇前期大鼠的胎盤、腎臟、肝臟、腦的病理損傷
　　鎘造成的病理損傷表現(xiàn)為胎盤絨毛血管擴張充血、迷路區(qū)血管間膜明顯增厚以及廣泛纖維蛋白沉積，見炎癥細胞浸潤。腎小球內(nèi)皮細胞腫脹和腎間質(zhì)小動脈管壁明顯增厚并伴有炎癥細胞聚集。肝細胞濁腫，甚至出現(xiàn)局灶性壞死。腦血管充血、灶區(qū)出血、腦水腫，腦神經(jīng)細胞變性。電鏡下可見胎盤滋養(yǎng)細胞胞質(zhì)內(nèi)細胞器減少，絨毛突起減少甚至缺失，線

9、粒體腫脹和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒。
　　3.鎘與臨床子癇前期的關(guān)系
　　電感耦合等離子體質(zhì)譜法測血鎘的濃度結(jié)果表明，子癇前期孕婦血中的鎘的濃度相比于正常妊娠明顯升高(p＜0.05）。同時子癇前期孕婦血中鈣與鋅的濃度降低，與血鎘濃度呈負相關(guān)(p＜0.05），子癇前期合并FGR組的孕婦血鎘濃度高于子癇前期合并非FGR組(p＜0.05）。
　　4.鎘促進孕鼠、胎盤、胎兒皮質(zhì)激素濃度升高
　　孕期0.5mg/kg染鎘組孕鼠的妊

10、娠第20天其母血及仔鼠血漿中皮質(zhì)酮濃度和對照組相比明顯升高(p＜0.01)。相應(yīng)的，0.5mg/kg的鎘處理組胎盤皮質(zhì)酮也升高(p＜0.01)。0.25-1.0μM鎘刺激JEG-3細胞以后，在1.0μM濃度皮質(zhì)醇的濃度最高(p＜0.05）。
　　5.鎘上調(diào)胎盤糖皮質(zhì)激素合成酶的表達
　　用鎘刺激后大鼠胎盤的CYP11A1、CYP21、CYP11B1基因表達與對照組相比增加（分別是p＜0.05，p＜0.01，p＜0.01），免

11、疫組化的結(jié)果顯示CYP11B1表達于大鼠胎盤的迷路區(qū)，人胎盤的合體滋養(yǎng)層細胞的胞膜，在子癇前期的表達明顯高于對照組(p＜0.05）。用1μM的鎘刺激JEG-3細胞24h后，CYP11A1及CYP11B1基因及蛋白的表達明顯升高（p＜0.05）。
　　6.鎘通過調(diào)節(jié)胎盤11β-HSD的表達使糖皮質(zhì)激素活化
　　用鎘刺激后大鼠胎盤的11β-HSD2基因表達與對照組相比明顯下降(p＜0.05)，對11β-HSD1及糖皮質(zhì)激素受體表

12、達沒有明顯影響(p＞0.05），子癇前期胎盤免疫組化的結(jié)果顯示與基因表達一致。用1μM的鎘刺激JEG-3細胞24h后，11β-HSD2基因及蛋白的表達明顯下降(p＜0.05）。胎盤局部分泌的糖皮質(zhì)激素不受ATCH及cAMP的調(diào)控。
　　實驗結(jié)論：
　　1.本研究成功用重金屬鎘誘發(fā)孕鼠出現(xiàn)高血壓及蛋白尿臨床癥狀，對胎盤和腎臟等臟器的造成病理損傷，符合子癇前期樣的癥狀及病變特征。子癇前期患者血中鎘的水平明顯升高。
　　2.