可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑的篩選的及抗炎作用的研究.pdf

1、[目的]
　　 可溶性環(huán)氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolase，sEH)是花生四烯酸代謝的關鍵酶之一，參與機體內炎癥、癌變和心血管系統(tǒng)病變等多種病理過程。抑制sEH，可以起到抗炎、抗動脈粥樣硬化、降血壓和抗癌的作用，因此sEH成為了抗炎、抗動脈粥樣硬化等藥物開發(fā)的新靶點。目前已開發(fā)的sEH抑制劑均為化學合成，代謝快，毒性高，成本高，應用價值較低。本課題以sEH為靶點，從天然藥物成分中篩選低毒高效的sEH

2、抑制劑，探討其抑制機理，并觀察其抗炎作用，為開發(fā)新的天然類抑制劑打下基礎。
　　 [方法]
　　 1.選擇三種細胞：小鼠巨噬細胞株RAW264.7、人臍靜脈內皮細胞HUVEC和人肝癌細胞株Huh7，建立最佳培養(yǎng)條件，比較三種細胞內酶活性，選擇適合的細胞建立sEH抑制劑篩選模型；
　　 2.選擇一系列具有抗癌、抗炎、降血壓、降血脂等中藥或單體等作為待選藥物，MTT法檢測細胞毒性確定低毒性藥物濃度；
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3、.每種藥物選擇兩個低毒性濃度，使用商品化的試劑盒測定藥物處理后細胞內sEH酶活性，與溶劑對照組比較，確定藥物對酶活性影響；
　　 4.針對篩選出的藥物，設計濃度梯度進行進一步的酶活性抑制檢測，檢測酶活性抑制是否具有劑量依賴性，并確定最佳濃度；
　　 5.使用每種藥物的最佳濃度，檢測藥物對直接酶活性的抑制作用，RT-PCR和Western bloting檢測藥物對sEH mRNA和蛋白水平的影響。
　　 6.脂多糖

4、LPS誘導小鼠巨噬細胞RAW264.7建立炎癥模型，檢測篩選藥物對炎癥模型的影響：Griess法檢測一氧化氮的變化，DCFH-DA熒光探針檢測活性氧的變化，ELISA法檢測白介素-1和腫瘤壞死因子α的變化，EIA法檢測篩選藥物對花生四烯酸COX-2通路關鍵酶COX-2活性的影響，RT-PCR和Western bloting檢測藥物對COX-2基因表達。
　　 [結果]
　　 經比較，肝癌細胞Huh7可作為sEH抑制劑篩選

5、模型，通過可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑篩選模型，篩選出原花青素、青藤堿、槲皮素、黃芩素、木犀草素5種藥物劑量依賴性抑制sEH酶活性；探討藥物對酶活性抑制機理，這些藥物對sEH直接酶活性無明顯抑制作用，而對sEH mRNA和酶蛋白表達均有明顯抑制作用。原花青素和木犀草素能有效降低炎癥模型中一氧化氮、活性氧、白介素-1β和腫瘤壞死因子α等一系列炎癥因子的水平，下調COX-2活性和基因表達。
　　 [結論]
　　 成功建立sEH