基于L-精氨酸骨架的氨肽酶N抑制劑的設(shè)計(jì)、合成及活性研究.pdf

1、氨肽酶N(APN)是一類膜型鋅離子依賴性的外肽酶，在很多組織如小腸、腎、肝以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中都有廣泛分布。該酶參與了營(yíng)養(yǎng)素的最終水解和生物活性分子如腦啡肽和內(nèi)啡肽的降解失活。另外，氨肽酶N也是冠狀病毒的受體，并參與了抗原遞呈的過(guò)程。更為重要的是，Saiko等人確定氨肽酶N在腫瘤細(xì)胞表面高水平表達(dá)，被稱作腫瘤細(xì)胞標(biāo)記物或相關(guān)抗原CD13。它在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移和新生血管的生成等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。因此氨肽酶N成為抗腫瘤藥物研究的

2、一個(gè)重要靶點(diǎn)。
　　 到目前為止人源氨肽酶N的晶體結(jié)構(gòu)未見(jiàn)報(bào)道。2006年Kiyoshi等人報(bào)道了大腸桿菌氨肽酶N(eAPN)以及eAPN與其特異性抑制劑Bestatin共結(jié)晶復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。eAPN的晶體結(jié)構(gòu)表明氨肽酶N活性區(qū)域至少包含有一個(gè)陰離子結(jié)合位點(diǎn)和三個(gè)疏水性口袋。三個(gè)疏水性口袋分別是位于鋅離子左側(cè)的S1口袋和右側(cè)的S1'和S2'口袋。這為氨肽酶N抑制劑的合理藥物設(shè)計(jì)奠定了基礎(chǔ)。
　　 本研究以氨肽酶N為靶點(diǎn)

3、，基于Bestatin與eAPN作用模式，通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)，構(gòu)建出抑制劑的藥效團(tuán)模型，然后結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研和本課題組已有的研究成果確定以L-精氨酸為母體骨架。在構(gòu)建的L-精氨酸母核的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，根據(jù)eAPN的三維結(jié)構(gòu)要求，將其側(cè)鏈進(jìn)行結(jié)構(gòu)衍生化。在合成目標(biāo)化合物之前，首先利用SYBYL7.0中的FlexX軟件對(duì)所設(shè)計(jì)的化合物進(jìn)行了對(duì)接打分，結(jié)果顯示大部分化合物分值都接近于甚至超過(guò)陽(yáng)性對(duì)照Bestatin。這說(shuō)明了我們?cè)O(shè)計(jì)思路的合理性，

4、為我們的研究提供了理論依據(jù)。
　　 本研究的合成工作以L-精氨酸為起始原料，首先將L-精氨酸的胍基用硝基保護(hù)，再將其羧基進(jìn)行甲酯化保護(hù)得到關(guān)鍵中間體，然后將中間體與芳酰氯，芳磺酰氯，芳酸，Boc保護(hù)的氨基酸或者各種類二肽縮合，最后將羧酸甲酯轉(zhuǎn)化成異羥肟酸，脫Boc保護(hù)基得到兩個(gè)系列的目標(biāo)化合物，即類二肽化合物(A系列)和類三肽化合物(B系列)。
　　 本文共設(shè)計(jì)、合成了107個(gè)目標(biāo)化合物，并通過(guò)紅外光譜、核磁共振氫譜、電

5、噴霧質(zhì)譜，高分辨質(zhì)譜等方法對(duì)化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確證。經(jīng)文獻(xiàn)檢索證明，所合成的目標(biāo)化合物均為新型化合物，未見(jiàn)報(bào)道。對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行了體外抑酶實(shí)驗(yàn)、體外抑制HL-60、K562、ES-2、A549、PLC及H7402細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，體內(nèi)動(dòng)物抑瘤實(shí)驗(yàn)等，以期篩選出高活性的氨肽酶N抑制劑。
　　 體外抑酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，B系列化合物相對(duì)于A系列化合物活性有所提高，且兩個(gè)系列的化合物對(duì)APN的抑制活性都優(yōu)于MMP-2。A系列中的A18和A21活

6、性較好，IC50達(dá)到了5.3和5.1μM(Bestatin，IC50=3.1μM)。B系列化合物中B47，B50和B52的IC50分別達(dá)到了64.8，53.4和59.0μM，接近于陽(yáng)性對(duì)照Bestatin(IC50=51.8μM)。
　　 MTT法體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)測(cè)定了體外抑酶活性較好的11個(gè)化合物對(duì)高表達(dá)APN/CD13的HL-60、ES-2、A549、PLC細(xì)胞以及低表達(dá)APN的K562、H7402細(xì)胞的增殖抑制活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

7、明我們的化合物對(duì)APN高表達(dá)的細(xì)胞都有較好的抑制作用，對(duì)于APN低表達(dá)的H7402細(xì)胞抑制作用比較差，但是對(duì)另外一種APN低表達(dá)的細(xì)胞K562的抑制活性卻比較好，其原因還有待于進(jìn)一步的研究分析。化合物A22對(duì)于六種腫瘤細(xì)胞都顯示出了很好的活性，可以對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。
　　 體內(nèi)動(dòng)物抑瘤實(shí)驗(yàn)選取了體外抗細(xì)胞增殖作用好的A22，B46，BS0和B52四個(gè)化合物進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明化合物A22和BS0能明顯減少荷肝癌

8、H22小鼠的肺部結(jié)節(jié)數(shù)目，即能明顯抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，抑制率也超過(guò)了陽(yáng)性對(duì)照藥Bestatin，分別達(dá)到了61.50％和71.39％(Bestatin的抑制率為58.04％)。
　　 本文在所有化合物活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行了初步定量構(gòu)效關(guān)系的研究。構(gòu)建了QSAR模型，對(duì)于指導(dǎo)以后同類化合物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化有一定的指導(dǎo)作用。
　　 本研究的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)是：①基于eAPN的晶體結(jié)構(gòu)及Bestatin與eAPN的作用模