參與休克血管反應性和鈣敏感性調(diào)控的PKC亞型及其MLC-,20-磷酸化調(diào)控機制.pdf

1、嚴重創(chuàng)傷/休克失代償期常出現(xiàn)血管低反應性，主要表現(xiàn)為全身血管對縮血管物質(zhì)和舒血管物質(zhì)的反應降低或不反應，本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，除了以往認識的血管低反應性發(fā)生的血管平滑肌細胞，的K+和Ca2+通道功能障礙、VSMC膜超極化之外，鈣失敏，即血管平滑肌細胞收縮蛋白對鈣的敏感性降低，也就是力/鈣比率和肌肉收縮效率的降低，也是休克血管低反應性發(fā)生的重要原因；蛋白激酶C參與了休克后血管反應性和鈣敏感性的調(diào)控。PKC是一組磷脂依賴性的鈣激活的蛋白絲氨

2、酸/蘇氨酸激酶，按生化性質(zhì)及結構可分為三大類：傳統(tǒng)型PKC：包括PKCα、βII、βI、γ；新型PKC：包括PKCδ、ε、η、θ；非典型PKC(atypical PKC，aPKC)：包括PKCζ、l、λ。在大鼠主動脈和腸系膜上動脈發(fā)現(xiàn)，主要表達PKCα、PKCδ、PKCε和PKCζ四種收縮功能相關亞型。但是哪些亞型參與失血性休克后血管反應性和鈣敏感性的調(diào)節(jié)，其機制如何?尚不清楚。據(jù)此，我們利用大鼠失血性休克模型和缺氧處理體外培養(yǎng)血管平滑

3、肌細胞模型，研究了參與失血性休克后鈣敏感性和血管反應性調(diào)節(jié)的PKC亞型，并從MLC20磷酸化的非鈣依賴性調(diào)節(jié)途徑入手研究其機制，以及缺血預適應和藥物預處理對其的誘導作用。主要內(nèi)容包括三部分：①明確參與失血性休克后血管反應性和鈣敏感性調(diào)節(jié)的PKC亞型；②研究相關PKC亞型調(diào)節(jié)休克血管鈣敏感性的MLC20磷酸化機制；③觀察缺血預適應和吡那地爾預處理對PKC的誘導作用及其對失血性休克大鼠血管反應性和鈣敏感性的保護作用。 主要實驗方法：

4、 第一部分明確參與失血性休克后血管反應性和鈣敏感性調(diào)節(jié)的PKC亞型 1.采用失血性休克大鼠腸系膜上動脈的一級分支血管環(huán)，測定不同休克時間點(40 mmHg，即時、30min、1 h、2 h、4 h)血管環(huán)的血管反應性(用血管環(huán)對梯度濃度NE的收縮反應反映)和鈣敏感性(用血管環(huán)對梯度濃度鈣離子的收縮反應反映)，觀察變化規(guī)律。 2.采用失血性休克大鼠(40 mmHg，2 h)的腸系膜上動脈的一級分支血管環(huán)，觀察各亞型

5、PKC的激動劑和抑制劑對休克2h血管反應性、鈣敏感性的影響。 3.采用失血性休克大鼠腸系膜上動脈，測定休克不同時間點(40 mmHg，，即時、30min、1 h、2 h、4 h)相關亞型PKC的mRNA表達、在胞漿和胞膜的蛋白表達，觀察變化規(guī)律。 第二部分相關亞型PKC調(diào)控失血性休克大鼠血管鈣敏感性的MLC20磷酸化機制 1.采用失血性休克大鼠(40 mmHg，2 h)的腸系膜上動脈一級分支血管環(huán)，觀察CPI-1

6、7、ILK和ZIPK的拮抗劑(褪膜后應用CPI-17、ILK和ZIPK的中和抗體)對相關亞型PKC激動劑調(diào)節(jié)休克血管敏感性作用的影響，明確相關亞型PKC調(diào)控休克血管鈣敏感性是否與CPI-17、ILK和ZIPK有關。 2.采用缺氧培養(yǎng)的腸系膜上動脈VSMC(缺氧處理2h，)，觀察相關亞型PKC激動劑對缺氧后CPI-17磷酸化和表達、以及ILK、ZIPK的活性和表達的影響，明確相關亞型PKC究竟通過是影響CPI-17、ILK和ZIP

7、K的活性還是表達來調(diào)控鈣敏感性。 3.采用缺氧培養(yǎng)的腸系膜上動脈VSMC(缺氧處理2h)，應用免疫共沉淀和westernblot技術觀察缺氧2h后，以及相關亞型PKC激動劑處理后，CPI-17、ILK、ZIPK和相關亞型PKC之間的相互作用關系，以及CPI-17、ILK和ZIPK之間的相互作用關系。 4.采用缺氧培養(yǎng)的腸系膜上動脈VSMC(缺氧處理2h，)，觀察相關亞型PKC激動劑及CPI-17、ILK和ZIPK抑制劑對

8、缺氧血管平滑肌細胞MLCP活性的影響；采用失血性休克大鼠(40 mmHg，2 h)的腸系膜上動脈，觀察相關亞型PKC激動劑及CPI-17、ILK和ZIPK抑制劑對休克后血管MIC20磷酸化的影響，分析CPI-17、ILK和IPK調(diào)節(jié)休克后血管鈣敏感性與MLCP和MLC20的關系。 第三部分觀察缺血預適應和吡那地爾預處理對PKC的誘導作用及其對失血性休克大鼠血管反應性和鈣敏感性的保護作用 1.觀察不同失血量(2.5％、5％

9、、10％)預處理不同時間(30min、1h、2h、3h)后，以及不同劑量吡那地爾(12μg/kg體重、25μg/kg體重、50μg/kg體重)預處理不同時間(30min、1h、2h、3h)對失血性休克大鼠(40 mmHg，2 h)的NE(3μg/kg體重)的升壓作用和縮血管作用的影響，以及對腸系膜上動脈一級分支血管環(huán)的血管反應性和鈣敏感性的影響，確定可誘導對失血性休克后血管反應性保護作用的缺血預適應和吡那地爾預處理條件。 2.觀

10、察相關亞型PKC拮抗劑對缺血預適應和吡那地爾預處理(5％失血量以及25μg/kg體重吡那地爾預處理30min)誘導的對失血性休克大鼠(40 mmHg，2 h)血管反應性和鈣敏感性保護作用的影響。以及觀察缺血預適應和吡那地爾預處理對失血性休克大鼠(40 mmHg，2 h)腸系膜上動脈相關亞型PKC胞漿和胞膜蛋白表達的影響。 主要結果： 一、參與失血性休克后血管反應性和鈣敏感性調(diào)節(jié)的PKC亞型 1.失血性休克后大鼠腸

11、系膜上動脈對NE和Ca2+的收縮反應性在休克早期增高(P<0.01)，從休克30min開始降低(P<0.01)，并隨著休克時間延長逐漸降低(P<0.01)。 2.PKCα激動劑thymelea toxin、PKCe激動劑carbachol和PKCδ的非特異性激動劑PMA可顯著增高休克2h大鼠腸系膜上動脈對NE和Ca2+的收縮反應性(P<0.01)，PKCα抑制劑Go-6976和PKCe假底物抑制肽可顯著降低休克大鼠腸系膜上動脈對

12、NE和Ca2+的收縮反應性(P<0.01)，但PKCζ的激動劑和抑制劑不改變休克大鼠腸系膜上動脈對NE和Ca2+的收縮反應性，PKCδ的抑制劑不能抑制PMA的增高休克大鼠腸系膜上動脈對NE和Ca2+收縮反應性的作用。 3.PKCα和PKCε的mRNA表達在失血性休克后逐漸增高(P<0.01)。失血性休克后，PKCα和PKCε在胞漿部分的蛋白表達降低(P<0.01)，而在胞膜部分的蛋白表達增高(P<0.01)，呈現(xiàn)由胞漿向胞膜的轉

13、位。 二、相關亞型PKC調(diào)控失血性休克大鼠血管鈣敏感性的MLC20磷酸化機制 1.PKCα激動劑thymelea toxin和PKCε激動劑carbachol可部分恢復休克大鼠腸系膜上動脈的鈣敏感性(P<0.01)，CPI-17、ILK和ZIPK的中和抗體可消除PKCα和ε激動劑對休克血管鈣敏感性的恢復作用(P<0.01)。 2.缺氧2h的VSMC中CPI-17、ILK和ZIPK的蛋白表達、CPI-17磷酸化、I

14、LK和ZIPK活性均降低(P<0.01)，PKCα激動劑thymelea toxin和PKCe激動劑carbachol可增高其蛋白表達，增高CPI-17磷酸化、以及ILK和ZIPK活性(P<0.01)。 3.PKCα的免疫沉淀中可雜交出ILK和ZIPK，尤其是ILK的蛋白條帶，不能雜交出CPI-17的蛋白條帶，PKCe的免疫沉淀中可雜交出ILK和ZIPK的蛋白條帶，也不能雜交出CPI-17的蛋白條帶，CPI-17的免疫沉淀中可雜

15、交出ILK和ZIPK的蛋白條帶，ILK的免疫沉淀中可雜交出ZIPK的蛋白條帶。 4.缺氧2h的VSMC中，MLCP活性顯著增高(P<0.01)，休克2h的大鼠腸系膜上動脈中MLC20磷酸化顯著降低(P<0.01)，PKCα和PKCε激動劑可降低缺氧后的MLCP活性(P<0.01)，增高休克后的MLC20磷酸化(P<0.01)，CPI-17、ILK和ZIPK的中和抗體可逆轉PKCα和PKCε激動劑對缺氧后MLCP活性和MLC20磷

16、酸化的作用(P<0.01)。 三、缺血預適應和吡那地爾預處理對PKC的誘導作用及其對失血性休克大鼠血管反應性和鈣敏感性的保護作用 1.缺血預處理和吡那地爾預處理可改善失血性休克2h后NE誘導的升壓效應和縮血管效應，改善SMA的血管反應性和鈣敏感性，以5％失血量預適應30min和25μg/kg吡那地爾預處理30min效果最好(P<0.01)。 2.PKCα抑制劑Go-6976和PKCε假底物抑制肽可顯著抑制缺血預適

17、應(5％失血量預適應30min)和吡那地爾預處理(25μg/kg吡那地爾預處理30min)誘導的對失血性休克2h后SMA一級分支血管反應性和鈣敏感性的保護作用(P<0.01)。缺血預適應和吡那地爾預處理可誘導失血性休克后的PKCα和PKCε由胞漿向胞膜轉位(P<0.01)。 結論： 1.PKCα和PKCε是參與大鼠失血性休克后血管反應性和鈣敏感性調(diào)節(jié)的主要PKC亞型，也是失血性休克后血管反應性的重要內(nèi)源性保護分子。