枳(Poncirus trifoliata)低溫相關microRNAs鑒定及ptf-miR396b抗寒功能研究.pdf

1、miRNAs(microRNAs)是普遍存在于動植物體內的一類內源保守非編碼小分子RNA，miRNA和AGO蛋白結合形成RISC復合物，在轉錄后水平對其靶基因mRNA進行剪切或翻譯抑制，從而調控靶基因的表達水平。miRNA參與調控植物的生長、發(fā)育、開花結果、衰老、死亡及對非生物、生物逆境脅迫響應等。枳（Poncirus trifoliata）是柑橘近緣屬，抗寒性強，但枳中響應低溫的miRNAs卻很少有研究。本研究采用高通量測序、生物信息

2、學分析等技術挖掘枳低溫相關miRNAs，研究這些miRNAs與其靶基因在枳應答低溫脅迫中的功能。主要實驗結果如下:
　　1.以低溫4℃馴化3d(CA)和未馴化（Control）的枳葉片進行高通量小分子RNA測序。對高通量測序結果進行生物信息學分析，共鑒定出107個保守miRNAs，分別屬于44個miRNA家族，有36個miRNAs響應低溫脅迫，其中14個miRNAs在其它物種中未見有參與低溫脅迫的報道。此外，預測了5個新miRNA

3、s。靶基因多數(shù)是轉錄因子，實時定量驗證了miRNAs表達與測序結果一致。
　　2.在柑橘不抗寒類型檸檬中超表達ptf-miR396b前體基因MIR396b，成熟ptf-miR396b表達水平在轉基因檸檬中大幅提高，且轉基因檸檬相比野生型表現(xiàn)出更強的抗寒性，組織化學染色和生理指標測定也證實了轉基因檸檬的抗寒性增強。5'-RACE和農(nóng)桿菌介導的瞬時轉化證實PtrACO是ptf-miR396b的靶基因，兩者在枳響應低溫脅迫中具有相反的表

4、達模式。實驗證明ptf-miR396b上調抑制PtrACO表達，進而抑制了乙烯合成，同時多胺合成相關基因被誘導上調，多胺含量積累量升高。轉基因檸檬低溫處理后，PtrACO表達水平比野生型更低，乙烯釋放量低于野生型，乙烯和多胺合成的共同底物SAM更多地進入多胺合成途徑，多胺合成相關基因表達水平及多胺積累量均高于野生型。ptf-miR396b通過調節(jié)其靶基因PtrACO的表達水平維持乙烯和多胺合成平衡，從而調控枳對低溫脅迫的響應。
　

5、　3.本實驗中發(fā)現(xiàn)兩個新的ptf-miRn02和ptf-miRn04產(chǎn)生于同一個莖環(huán)結構的兩條臂上，且ptf-miRn04的測序豐度比ptf-miRn02高，ptf-miRn02可能是ptf-miRn04的miRNA*，本章克隆鑒定了枳ptr-miRn04及ptr-miRn02的成熟序列和前體序列，預測ptf-miRn04的靶基因是PtrFBA基因，該基因參與糖代謝且與ptr-miRn04的表達水平呈反向相關，在煙草中超表達ptf-mi