肝癌轉移特征性microRNAs的篩選及功能鑒定.pdf

1、論文題目肝癌轉移特征性microRNAS的篩選及功能鑒定SereeningandMetastasis一assoeiatedMieroRNAsIdentifieationofinHumanHePatoeellularCareinoma導師組成員:孫惠川教授王魯副教授本課題由國家自然科學基金(30670953，81071904)和國家科技重大專項(2008ZX10002一021)項目資助復旦大學碩士學位論文中文摘要背景與目的:miCrNAs

2、(miRNAs)是一種短鏈非編碼小RNA，通過與其靶基因mRNA3’UTR區(qū)結合發(fā)揮轉錄后抑制作用，進而調節(jié)細胞凋亡、分化、代謝、運動以及參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。近年來有研究證實，miRNAS的差異表達與肝癌的轉移、藥物治療反應性以及預后相關。本研究著重探索人肝癌轉移過程中差異表達miRNAs，并鑒定其中關鍵miRNAS的生物學功能，以期進一步理解肝癌轉移的分子機制，為肝癌的個體化治療提供線索。方法:應用miRNAs表達譜芯片檢測裸鼠原位

3、移植瘤肝癌原發(fā)灶和肺轉移灶中miRNA表達，根據SAM的差異倍數篩選肝癌侵襲轉移鏈特異性差異表達miRNAS譜利用生物信息學技術分析并構建差異表達miRNAS的生物學事件調控網絡Poly(A)real一tifnePCR檢測miRNAS的表達水平Real一timePCR和Westernblot分別檢測功能基因的mRNA和蛋白質水平Trans一wen和BDMatrigel用來觀察細胞的遷移、侵襲能力進而對miR612的靶基因及相關信號通路進

4、行生物信息學再預測和功能富集分析構建Dual一LuCiferaserepterveCt直接驗證miR612的靶基因。通過miR丁DINAmimie和hairpininhibit及LipofeCtamin2000細胞轉染技術，實現miR612的瞬時過表達或封閉表達。利用AKTZ選擇性抑制劑VIH阻斷AKTZ的活化和下游信號通路的激活。尾靜脈注射裸鼠模型在體觀察腫瘤的肺轉移能力。結果:1)在肝癌侵襲一轉移鏈中特異性差異表達miRNAS有32

5、條，其中上調15條，下調17條聚類分析可將上述32條差異表達miRNAS歸類為原發(fā)灶和肺轉移灶兩種獨特表達模式根據預測的靶基因這些差異表達miRNAS可能參與18項生物學事件2)在HCCLM3、MHCC97H、MHCC97L、HepGZ和SMMC一7721中miR612的表達水平呈逐漸升高趨勢，其中SMMC一7721的表達水平是HCCLM3的巧倍，表明miR612的表達水平與不同來源肝癌細胞的侵襲轉移潛能呈負相關:3)在HCCLM3、M

6、HCC97H及MHCC97L細胞中miR612的水平與其遷移、侵襲能力呈反向關系在HCCLM3不同亞克隆中，miR612表達也存在顯著性差異，而這種差異與不同亞克隆的遷移、侵襲能力呈負相關。4)miRID工NAmimiCS瞬時轉染能夠顯著抑制HCCLM3、HePGZ細胞的遷移和侵襲能力，而hairPininhibit封閉miR61272h后可顯著增加遷移和侵襲能力5)應用miRa，TargetSCan以及mirargetZ方法對miR6