超促排卵和體外成熟人卵子中印跡基因H19和PEG1甲基化狀態(tài)的實驗研究.pdf

1、目的： 基因印跡是指親緣依賴性單等位基因表達，即父源和母源等位基因中只有一個表達，其遺傳方式不符合經(jīng)典的孟德爾遺傳規(guī)律。印跡基因的功能主要與胚胎形成和發(fā)育、胎兒生長及胎盤分化等有關(guān)[1]?；蛴≯E的主要方式是等位基因差異性甲基化，發(fā)生于配子形成過程中，當生殖細胞遷入生殖嵴后就開始了母代印跡的去除及子代相應(yīng)印跡的建立[2-4]。印跡一旦建立，其甲基化狀態(tài)在后續(xù)的各級發(fā)育中維持不變，即使在受精后廣泛的基因組去甲基化過程中，印跡基因的

2、甲基化狀態(tài)也維持不變，直到下一代胚胎早期，生殖細胞發(fā)育時印跡才得以去除。人類輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology，ART)中廣泛使用的超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation，COH)、卵子體外成熟培養(yǎng)(in vitro maturation， IVM)、胚胎體外操作和培養(yǎng)等在印跡形成和維持的關(guān)鍵時期進行，很可能會導(dǎo)致印記異常的發(fā)生。近來研究發(fā)現(xiàn)，ART存

3、在的胚胎種植率低、自發(fā)流產(chǎn)危險增加、低體重出生兒比例上升和先天畸形率增高等問題可能和印跡異常有關(guān)，而ART出生后代的Angelman綜合征(AS)和Beckwith-Wiedemann綜合征(BWS)等罕見印跡遺傳性疾病的發(fā)病率增高[5]，提示ART可能導(dǎo)致印跡異常。研究配子印跡基因的甲基化狀態(tài)是了解ART相關(guān)過程是否對印跡產(chǎn)生影響的一個重要途徑，單個細胞的甲基化信息更加準確。近年來的動物研究表明超促排卵(controlled ovar

4、ian hyperstimulation， COH)[6，7]、卵子體外成熟培養(yǎng)(in vitro maturation，IVM)[8，9]、使用圓形或長形精子細胞[10]、體外受精和胚胎培養(yǎng)[11，12]甚至胚胎移植[12]都可能導(dǎo)致基因印跡異常，但有關(guān)人類卵子的研究較少。缺乏人類卵子印記狀態(tài)研究的主要原因是：人類卵子來源的局限性及相關(guān)倫理問題的限制，而且標本僅含單個細胞，檢測技術(shù)難度大。 本研究的目的是：1)采用單細胞亞硫酸

5、氫鈉測序分析COH和IVM的各級卵子印跡基因H19和PEG1的甲基化狀態(tài)，以探討COH和IVM是否引起印跡基因甲基化異常；2)初步探討采用高分辨率熔解(high resolution melting，HRM)分析技術(shù)用于單個卵子的甲基化異常檢測，以建立簡便、快速、低費用的甲基化異常檢測方法。 方法： 來自單精子卵胞漿內(nèi)注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)治療周期的COH卵子和

6、來自IVM治療周期的IVM卵子采用透明質(zhì)酸酶和顯微玻璃管機械吹打體式顯微鏡下去除顆粒細胞，鹽酸(pH1.5)去除透明帶，倒置顯微鏡下確認卵細胞周圍已無顆粒細胞等體細胞；之后，使用改進的單細胞低熔點瓊脂糖包埋亞硫酸氫鈉處理的方法進行處理。通過半巢式、雙重PCR擴增H19的18個CpG位點和PEG1的24個CpG位點。利用亞硫酸氫鈉將非甲基化的胞嘧啶(C)化學轉(zhuǎn)化為鳥嘧啶(U)，保留PCR擴增前細胞DNA的甲基化信息，通過克隆測序，分析CO

7、H和IVM的各級卵子印跡基因H19和PEG1的甲基化狀態(tài)。同時對第二輪PCR產(chǎn)物行HRM分析，分析HRM檢測甲基化異常的可能性。 結(jié)果： 122個卵子行單個卵子亞硫酸氫鈉處理后PCR，分別有58個COH和36個IVM卵子擴增成功，擴增成功率為77.0％，空白對照及陰性對照均未見擴增條帶。PCR產(chǎn)物克隆測序后，有7個卵子由于出現(xiàn)甲基化和非甲基化兩種甲基化類型，考慮為體細胞污染，體細胞污染率為7.4％。 8.5％(8

8、/94)卵子出現(xiàn)H19或PEG1的1～2個CpG位點的甲基化異常。91.4％卵子的H19是完全非甲基化的，而91.7％卵子的PEG1則是完全甲基化的，沒有出現(xiàn)所有CpG位點甲基化異常的卵子。在58個COH卵子中，33個卵子檢測H19，30個所有CpG位點完全非甲基化，1個MII卵子出現(xiàn)7號和10號兩個CpG位點甲基化，2個MII卵子分別出現(xiàn)7號或10號CpG位點甲基化；25個卵子檢測PEG1，22個卵子為完全甲基化，1個MI卵子出現(xiàn)14

9、號CpG位點非甲基化，2個MII卵子分別出現(xiàn)8號和18號兩個CpG位點非甲基化。IVM后成熟卵子皆行單精子卵胞漿內(nèi)注射，在36個未成熟卵子中，25個卵子行H19檢測，其中23個所有位點為完全非甲基化，1個MI和1個MII卵子分別出現(xiàn)7號和10號兩個CpG位點甲基化；檢測PEG1的11個卵子所有位點為完全甲基化。 對所有測序結(jié)果顯示被體細胞污染的卵子行HRM分析，其熔解曲線顯示含有2個熔解溫度(Tm)值，這兩個Tm值分別與沒有受到

10、污染的正常印跡的精子和卵子的Tm值一致。對甲基化狀態(tài)正常、有1個位點異常和有2個位點異常樣本通過HRM分析，顯示HRM可以區(qū)別這些不同的甲基化類型。 比較測序結(jié)果與HRM分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，測序結(jié)果顯示體細胞污染的樣本均能通過HRM分析獲得證實，而測序結(jié)果顯示正常的94個卵子中2個通過HRM分析發(fā)現(xiàn)存在體細胞污染。這可能是測序時克隆數(shù)量較少導(dǎo)致的誤差所致。 結(jié)論： 我們的結(jié)果表明，PEG1已經(jīng)建立的甲基化沒有受到COH