VP3基因?qū)ξ赴┘?xì)胞SGC7901的作用和蛋白質(zhì)組的研究.pdf

1、目的：構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFP-N1-VP3并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞SGC-7901，觀察EGFP-VP3融合蛋白在腫瘤細(xì)胞中的分布和亞細(xì)胞定位，探討凋亡素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制。應(yīng)用雙向凝膠電泳（2-DE）結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)研究VP3誘導(dǎo)凋亡的SGC-7901細(xì)胞（實(shí)驗(yàn)組）與正常培養(yǎng)的SGC-7901細(xì)胞（對照組）的差異表達(dá)蛋白質(zhì)。利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法探討VP3對胃癌SGC-7901細(xì)胞作用的分子機(jī)制。 方法：用PCR技術(shù)擴(kuò)增出VP3基

2、因片段，克隆至載體pEGFP-N1，鑒定無誤后，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pEGFP-N1-VP3經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞，在熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察凋亡素在腫瘤細(xì)胞中的分布、亞細(xì)胞定位。用AO/EB熒光染色法檢測其在體外誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的效應(yīng)。通過雙向凝膠電泳分離VP3處理前后細(xì)胞總蛋白，并對IPG膠條（pH3-10，pH4-7）、SDS-PAGE濃度（10％，12％）、電泳時(shí)間（6h，7h）進(jìn)行優(yōu)化，PDQuest圖

3、像分析，MALDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定，Mascot軟件查詢SWISS-PORT蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，半定量RT-PCR檢測ICEBERGmRNA水平變化，Western blot在蛋白質(zhì)水平對ICEBERG進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果：經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析和DNA序列測定證實(shí)目的基因已插入重組質(zhì)粒，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中EGFP-VP3在腫瘤細(xì)胞中得以高表達(dá)，轉(zhuǎn)染后逐漸從細(xì)胞質(zhì)遷移至細(xì)胞核，最后定位于細(xì)胞核內(nèi)。AO/EB熒光染色觀察到大量細(xì)胞凋亡

4、。獲得分辨率高、重復(fù)性好的SGC-7901細(xì)胞雙向電泳圖譜，對照組樣本的2-DE圖譜檢測到862±36個(gè)蛋白點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組樣本檢測到648±27個(gè)蛋白點(diǎn)，二者主要蛋白點(diǎn)的位置與數(shù)量基本一致。圖像分析顯示有8個(gè)蛋白斑點(diǎn)表達(dá)有差異，經(jīng)MALDI-TOF-MS檢測，鑒定了6個(gè)可能蛋白，VP3處理后ATP5S、ICBR、TPC6A、TALDO、BAF、RDH13 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)均下調(diào)。 結(jié)論：成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFP-N1-VP