ILK在人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化中的表達(dá)變化及意義.pdf

1、目的：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCMSC)是從臍帶組織中分離的干細(xì)胞，取材簡(jiǎn)單易獲取，具有向神經(jīng)細(xì)胞分化的能力，為神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變和損傷的細(xì)胞移植治療提供一個(gè)新的細(xì)胞來(lái)源。但其分化機(jī)制尚不完全清楚。 目前，對(duì)UCMSC向多巴胺能神經(jīng)元誘導(dǎo)分化的研究較少，尚無(wú)UCMSC向神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞分化的報(bào)道，尚無(wú)ILK在UCMSC向神經(jīng)細(xì)胞分化中的作用的研究報(bào)道。本試驗(yàn)首先體外誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為臍帶源神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞hucNSC)

2、，并進(jìn)一步向神經(jīng)細(xì)胞及多巴胺能神經(jīng)元誘導(dǎo)分化，然后研究ILK在UCMSC向神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化中的表達(dá)變化，siRNA-ILK抑制ILK在神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞中的表達(dá)，檢測(cè)抑制ILK能否抑制UCMSC向神經(jīng)細(xì)胞的分化，進(jìn)一步驗(yàn)證ILK在UCMSC向神經(jīng)細(xì)胞的分化中的作用，對(duì)UCMSC向神經(jīng)細(xì)胞分化的機(jī)制進(jìn)行初步探討。 方法： 1. UCMSC的培養(yǎng)和鑒定 取足月妊娠剖宮產(chǎn)健康胎兒的臍帶，D-Hank's

3、液充分洗滌，將臍帶剪碎至0.5cm3大小組織塊，加入0.1％膠原酶Ⅱ中，37℃、CO2培養(yǎng)箱內(nèi)消化18h，將細(xì)胞接種于含20％FBS培養(yǎng)基中。取第3代臍帶MSCs，用0.25％胰蛋白酶消化，制成濃度為3.0×106/mL的單細(xì)胞懸液。分別加入抗人的CD44-PE、CD29-APC、CD105-FITC單抗各5μL，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面分子標(biāo)志。 2. 體外預(yù)誘導(dǎo)UCMSCs向神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞分化 取第3，4代生長(zhǎng)狀態(tài)良

4、好的UCMSCs，按1×105/mL接種于24孔板中培養(yǎng)和預(yù)誘導(dǎo)。預(yù)誘導(dǎo)分為三組：1、bFGF+EGF+B27；2、bFGF+EGF；3、bFGF+EGF+B27+1％FBS。藥物劑量濃度為：bFGF20ng/ml，EGF20ng/ml，B27為2％。在hucNSC形成后繼續(xù)培養(yǎng)2周后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面分子標(biāo)志CD44、CD29、CD105。免疫組織化學(xué)檢查分別檢測(cè)nestin、CD133、NSE、GFAP、TH表達(dá)變化。

5、 3. hucNSC 向神經(jīng)細(xì)胞及多巴胺能神經(jīng)元的誘導(dǎo) 將hucNSC細(xì)胞球接種于預(yù)先放置有多聚賴氨酸包被的消毒蓋玻片的24孔板中進(jìn)行誘導(dǎo)分化。按在DMEM/F12培養(yǎng)液中加用誘導(dǎo)劑的不同分四組進(jìn)行誘導(dǎo)：1組10％FBS；2組ATRA；3組GDNF+IL-1β；4組ATRA+GDNF+IL-1β，藥物劑量濃度為：GDNF10ng/ml，IL-1β10ng/ml，ATRA1.0μmol/l。誘導(dǎo)后觀察記錄細(xì)胞形態(tài)變化，免疫細(xì)胞化學(xué)

6、鑒定檢測(cè)NSE、GFAP和TH。RT-PCR檢測(cè)誘導(dǎo)后細(xì)胞NSE、GFAP和TH基因表達(dá)結(jié)果。 4. 分化過(guò)程中細(xì)胞骨架的變化 準(zhǔn)備hUCMSC、hucNSC和NC的一組細(xì)胞爬片后，0.1％TritonX-100通透5min，加AF488室溫孵育20min，免疫熒光顯微鏡下觀察并照相記錄。 5. ILK在分化過(guò)程中的表達(dá)變化 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)ILK在hUCMSC、hucNSC和NC的表達(dá)，RT-PCR定性

7、分析，實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析ILK基因表達(dá)變化。 6. 轉(zhuǎn)染siRNA干擾hucNSC中ILK的表達(dá) 根據(jù)ILK的NDA序列，由上海吉瑪公司合成siRNA，4組序列供選擇，將hucNSC細(xì)胞球培養(yǎng)約2周后，0.01％胰酶消化加機(jī)械吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液，按照HiPerFector說(shuō)明書(shū)，轉(zhuǎn)染hucNSC，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR，選出敲減ILK效果最好的siRNA序列。 7. 轉(zhuǎn)染siRNA干擾ILK

8、后hucNSC的增殖、凋亡和分化 MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染siRNA干擾ILK后hucNSC的增殖；按凋亡試劑盒處理轉(zhuǎn)染siRNA干擾ILK后的hucNSC，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡；用同一誘導(dǎo)方案(在DMEM/F12培養(yǎng)液中加用誘導(dǎo)劑ATRA、GDNF、IL-1β)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染siRNA-ILK和未轉(zhuǎn)染組，免疫組化檢測(cè)誘導(dǎo)后細(xì)胞表達(dá)NSE、GFAP和TH標(biāo)志物的比例。 結(jié)果： 1. UCMSC的培養(yǎng)和鑒定 在原代培養(yǎng)

9、2天后，可觀察到大量成纖維細(xì)胞樣貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)。在2周時(shí)，細(xì)胞達(dá)到80％～90％匯合程度；經(jīng)消化后按1∶2～1∶3的比例傳代的細(xì)胞。于接種后數(shù)小時(shí)內(nèi)可見(jiàn)其迅速貼壁，約5天后，細(xì)胞完全匯合在低倍鏡下呈排列緊密的漩渦樣結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)10代余后的細(xì)胞的形態(tài)未見(jiàn)明顯變化，增殖趨勢(shì)也相對(duì)穩(wěn)定。流式細(xì)胞檢測(cè)證實(shí)這些細(xì)胞表達(dá)MSCs標(biāo)志物CD29、CD44和CD105。 2. hUCMSCs形成神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞 hUCMSCs在加入預(yù)誘導(dǎo)液

10、(含bFGF、EGF、B27)后24h內(nèi)，細(xì)胞聚集成叢、成堆，由細(xì)長(zhǎng)梭形變?yōu)榘w為圓形或短梭形，細(xì)胞團(tuán)可由數(shù)個(gè)至數(shù)百個(gè)不等細(xì)胞胞體聚集，周圍伸出不規(guī)則短突起，72h內(nèi)，胞體逐漸融合鏡下分不清單個(gè)細(xì)胞界限，突起逐漸縮短直至形成懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞球。含血清或不加B27的培養(yǎng)基無(wú)細(xì)胞球形成。流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)表明，hucNSC失去原h(huán)UCMSC的細(xì)胞表型，CD29、CD44、CD105主要表面標(biāo)志表達(dá)陰性。細(xì)胞聚集時(shí)nestin即表達(dá)陽(yáng)性，形成的懸浮

11、細(xì)胞球nestin、CD133呈強(qiáng)表達(dá)，而不表達(dá)GFAP、NSE、TH等。 3. hueNSC向神經(jīng)細(xì)胞及多巴胺能神經(jīng)元的誘導(dǎo) 在hucNSC培養(yǎng)2周后加入含10％FBS培養(yǎng)基后，細(xì)胞球逐漸分解，放射狀伸出細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)不似原UCMSC，也無(wú)神經(jīng)細(xì)胞的典型形態(tài)，少數(shù)細(xì)胞有較長(zhǎng)的突起。加入含有IL-1β、GDNF、RA、的培養(yǎng)液，2～3 d后可見(jiàn)細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，有的伸出很長(zhǎng)的突起，細(xì)胞立體感強(qiáng)，胞核清晰，有活力，聚集的細(xì)胞逐

12、漸分散生長(zhǎng)，10～17d后則許多細(xì)胞體積逐漸縮小，逐漸變成小的卵圓形或圓形，不帶突起或向兩極伸出突起，也有的細(xì)胞呈短梭形帶有長(zhǎng)長(zhǎng)的突起或小圓胞體帶有多突起，胞體折光性強(qiáng)，有的胞體不規(guī)則但突起較多，細(xì)胞突起可見(jiàn)連接成網(wǎng)。免疫細(xì)胞化學(xué)分析結(jié)果：加入10％FBS僅出現(xiàn)少量的GFAP分化細(xì)胞，加入含有IL-1β、GDNF、RA組GFAP為21.1±3.5％，NSE為57.4±4.3％，TH為9.2％±3.1％，明顯高于單獨(dú)應(yīng)用RA或IL-1β、

13、GDNF各組，p<0.01。RT-PCR分析進(jìn)一步在mRNA水平上證實(shí)了誘導(dǎo)的細(xì)胞神經(jīng)標(biāo)志物表達(dá)GFAP、NSE、TH。 4. hUCMSCs向神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞分化過(guò)程中細(xì)胞骨架的變化 hUCMSCs細(xì)胞內(nèi)F-acting呈縱向絲狀規(guī)律排列，hucNSC細(xì)胞聚集成球，細(xì)胞骨架回縮，呈巢狀，無(wú)伸展形態(tài)，誘導(dǎo)后的神經(jīng)細(xì)胞胞體F-acting呈網(wǎng)狀，細(xì)胞有極性形成，呈軸狀，相鄰細(xì)胞細(xì)胞骨架可連接成網(wǎng)。 5.

14、ILK在hUCMSCs向神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞分化過(guò)程中表達(dá)變化 (1) 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)未見(jiàn)hUCMSC中有ILK的表達(dá)，hucNSC呈懸浮狀態(tài)細(xì)胞中表達(dá)ILK，免疫熒光雙標(biāo)顯示同時(shí)表達(dá)nestin或CD133；在誘導(dǎo)后神經(jīng)細(xì)胞中，ILK繼續(xù)呈強(qiáng)表達(dá)， (2) RT-PCR和Real Time PCR檢測(cè)結(jié)果：ILK在hUCMSC中微量表達(dá)，在轉(zhuǎn)化為hucNSC后ILK表達(dá)明顯上調(diào)，進(jìn)一步誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞中ILK表達(dá)

15、仍維持較高水平；Real Time PCR定量分析顯示ILK在hucNSC中的表達(dá)水平是hUCMSC表達(dá)水平的12倍，ILK在誘導(dǎo)后神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)水平高于hUCMSC8.6倍，hUCMSC與誘導(dǎo)后的hucNSC、神經(jīng)細(xì)胞ILK表達(dá)均有顯著差異(卡方檢驗(yàn)，p<0.05)。 6. 轉(zhuǎn)染siRNA干擾ILK及轉(zhuǎn)染后hucNSC的增殖、凋亡和分化最佳siRNA序列，正義鏈：5'-GAAUCUCAACCGUAUUCCATT-3'，反義鏈

16、：5'-UGGAAUACG GU UGAGAUUCTG-3'，敲減率在75％以上。 轉(zhuǎn)染ILK-siRNA的細(xì)胞增殖活性明顯降低，72h抑止率為64.5±0.5％。轉(zhuǎn)染了ILK siRNA的細(xì)胞有11.2％的細(xì)胞在早期凋亡階段，9.1％的細(xì)胞在晚期凋亡階段或死亡。抑止hucNSC的ILK表達(dá)后，繼續(xù)向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化，結(jié)果GFAP為11.6±1.5％，NSE為16.3±2.1％，TH為1.5％±0.3％，在同一誘導(dǎo)條件下，和對(duì)照組相比各

17、種神經(jīng)細(xì)胞的分化比例均明顯降低(p<0.05)。 結(jié)論：從人臍帶中可用膠原酶消化法培養(yǎng)得到間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)如成纖維樣細(xì)胞，可傳代、凍存和復(fù)蘇，高水平表達(dá)CD29、CD44、CD105細(xì)胞表面標(biāo)志。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在EGF、bFGF、B27的無(wú)血清培養(yǎng)基預(yù)誘導(dǎo)作用下，可轉(zhuǎn)變?yōu)閼腋∩L(zhǎng)的細(xì)胞球，表達(dá)nestin和CD133，能增殖和傳代，在撤去EGF、bFGF、B27加入含血清培養(yǎng)基下，僅能分化為少量表達(dá)GFAP的細(xì)胞，尚不能