Pim-3，occludin及ICAM-1在受損腸黏膜中的表達規(guī)律和相關(guān)性的實驗研究.pdf

1、一、研究背景 腸道是體內(nèi)最大的貯菌庫和內(nèi)毒素庫，在正常情況下，腸屏障能阻止腸道內(nèi)細菌及其分解產(chǎn)物經(jīng)腸壁擴散至機體內(nèi)，但是，在嚴重感染、創(chuàng)傷、休克等應(yīng)激狀況下，腸道屏障功能受損，腸道內(nèi)微生物和內(nèi)毒素可通過受損的腸粘膜屏障侵入到體循環(huán)，形成腸源性感染，導(dǎo)致多器官功能障礙。因此，腸屏障功能已成為判斷危重患者預(yù)后的重要指標之一。也正因如此，如何有效保護腸黏膜屏障功能成為當前消化領(lǐng)域的研究熱點之一。以前這方面的研究思路主要集中在腸內(nèi)營養(yǎng)及

2、恢復(fù)腸內(nèi)正常微生態(tài)環(huán)境上，而利用原癌基因治療腸黏膜損傷卻少有涉及，對燒傷及內(nèi)毒素作用后腸道生物屏障的變化及其與原癌基因的相關(guān)性亦較少見報道。以往的研究證明，很多原癌基因在組織受損后都具有增量調(diào)節(jié)的作用。例如，c-fos、c-jun、egr-1、sp-1、表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、成纖維細胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子，所有這些基因產(chǎn)物都扮演著一個重要的修補角色，協(xié)助修復(fù)受損組織。原癌基因Pim-3編碼一種絲/蘇氨酸蛋白激酶Pim-3，它

3、廣泛表達于人類各種組織細胞中，可促進MAPK磷酸化，參與多個細胞信號通路的調(diào)控，它具有促進細胞生長和抑制凋亡的功能，在損傷組織的修復(fù)、治療中發(fā)揮積極作用。為此設(shè)想，Pim-3可能有修復(fù)腸黏膜損傷，保護腸道機械屏障功能的作用。而腸上皮細胞間的緊密連接是由緊密連接分子來完成，occludin就是其中的一個重要成員，并在腸道機械屏障中發(fā)揮重要作用。Fujibe等發(fā)現(xiàn)MAPK參與緊密連接分子occludin、Claudins等的表達調(diào)控。另外，

4、ICAM-1作為黏附分子，對淋巴細胞和中性粒細胞進入腸道有趨化、介導(dǎo)作用，一方面參與腸道免疫屏障功能，另一方面也促進了腸道的炎癥反應(yīng)。這已被大量的研究所證實。為此，本研究以30％TBSA燒傷大鼠及內(nèi)毒素損傷大鼠為模型，對燒傷或內(nèi)毒素引起腸黏膜損傷后相關(guān)基因(Pim-3、occludin、ICAM-1)的表達進行系統(tǒng)觀察，研究它們的表達規(guī)律并分析彼此間的相關(guān)性。為后續(xù)實驗提供實驗數(shù)據(jù)和理論支持。 二、總體思路 首先，選用健

5、康Wistar大鼠120只，雌雄各半，體重220±20g，按隨機表隨機分為四組：A組燒傷組，B組LPS組，C組.燒傷對照組，D組,LPS對照組。每組30只，各組均于處理后3h、6h、12h、24h、48h開腹取小腸組織，每組各時間點均為6只動物。建立30％TBSAⅢ燒傷大鼠模型及內(nèi)毒素大鼠模型，取燒傷皮膚做病理檢查以確定燒傷程度，在各時間點取小腸組織，一部分做病理檢查以確定腸黏膜損傷程度，另一部分用來檢測Pim-3、閉鎖蛋白(Occlu

6、din)以及細胞間黏附分子(ICAM-1)的mRNA和蛋白水平，了解燒傷或內(nèi)毒素處理后48小時內(nèi)Pim-3、occludin及ICAM-1的表達規(guī)律，并分析它們之間的相關(guān)性。 三、實驗?zāi)康摹⒎椒?、結(jié)果及結(jié)論 1.目的:通過建立成年大鼠30％TBSAⅢ燒傷模型和內(nèi)毒素大鼠模型，利用RT-PCR及western blotting等分子生物學方法檢測Pim-3 occludin及ICAM-1在損傷腸黏膜中的表達變化。研究它們的

7、表達規(guī)律并分析彼此間的相關(guān)性。為后續(xù)實驗提供實驗數(shù)據(jù)和理論支持。 2.方法:將實驗大鼠隨機分為四組：A組.燒傷組(n=30)；B組.內(nèi)毒素(LPS)組(n=30)；C組.燒傷對照組，D組.LPS對照組。各組依次在處理后3h、6h、12h、24h、48h取小腸組織，一部分進行常規(guī)HE染色及病理切片檢查，另一部分進行RT-PCR及Western blotting，分別檢測內(nèi)源性Pim-3、Occludin、ICAM-1在腸道的表達變

8、化。 3.結(jié)果 (1)燒傷皮膚的病理改變：大鼠燒傷區(qū)皮膚表皮缺如，真皮及皮下組織出現(xiàn)凝固性壞死，部分皮下肌肉組織出現(xiàn)肌溶解。 (2)小腸粘膜的病理改變：經(jīng)HE染色，可見燒傷后3 h腸絨毛出現(xiàn)水腫，內(nèi)皮脫落，粘膜固有層充血，炎性細胞浸潤，以后幾個時間點腸黏膜的病理改變與上面的相仿，沒有大的很明顯的變化，傷后48 h腸粘膜病變還未恢復(fù)正常。與燒傷組相比，內(nèi)毒素組小腸粘膜病理改變更為明顯，正常對照組無明顯變化。

9、 (3)Pim-3的檢測結(jié)果：正常大鼠小腸組織Pim-3 mRNA和蛋白水平低表達，而燒傷組和內(nèi)毒素組在3 h表達開始增多，6 h到達頂點，12 h開始下降，24 h、48 h低表達。燒傷組、內(nèi)毒素組內(nèi)源性Pim-3基因表達與各自對照組之間的差異有統(tǒng)計學意義，燒傷組3 h、6 h、12 h、24 h、48 h分別為對照組的12.25±1.24，21.13±1.78，14.21±1.12，2.12±0.11，1.08±0.07倍；內(nèi)毒素組

10、分別為對照組的15，08±1.07，25.24±2.11，16.32±1.23，2.15±0.13。1.10±0.08倍；燒傷組、內(nèi)毒素組之間的差異無統(tǒng)計學意義。 (4)occludin的檢測結(jié)果：在燒傷組，western blotting結(jié)果證實occludin蛋白水平在3小時和6小時升高。RT-PCR方法顯示，燒傷后3 h、6 h、12 h、24 h、48 h閉鎖蛋白mRNA量升高，分別為對照組的3.25±0.26、6.65

11、±0.44.、3.10±0.25，1.55±0.08.1.01±0.08倍：內(nèi)毒素組3 h、6 h、12 h、24 h、48 h分別為對照組的3.15±0.25，6.25±0.56，2.52±0.18，1.42±0.10，1.05±0.08倍。內(nèi)毒素組與燒傷組比較經(jīng)統(tǒng)計學檢驗無顯著性差異。 (5)ICAM—1的檢測結(jié)果：燒傷及內(nèi)毒素處理后ICAM-1 mRNA量增加，以12h高明顯。燒傷組3h、6h、12h、24h、48h為對照

12、組的12.12±1.32，18.16±1.68,19.31±1.74，15.53±1.46，12.12±1.12倍；內(nèi)毒素組3 h、6 h、12 h、24 h，48h分別為對照組的12.81±1.12，19.68±1.67，17.43±1.55，16.24±1.41，18.12±1.61倍。燒傷組、內(nèi)毒素組ICAM-1 mRNA的表達與對照組之間的差異有統(tǒng)計學意義；內(nèi)毒素組與燒傷組比較經(jīng)統(tǒng)計學檢驗無顯著性差異。 4.結(jié)論:在燒傷