蜱抗凝血肽與RGDS肽的重組基因構(gòu)建及真核表達.pdf

1、蜱抗凝血肽(tick anticoagulant peptide，TAP)是從軟蜱唾液內(nèi)分離鑒定出的抗凝分子，為60個氨基酸組成的單鏈酸性多肽，是一種慢速而結(jié)合緊密的具有高度選擇性的xa因子(Fxa)抑制劑，與Kunitz型抑制劑有同源性。在進行提高TAP對Fxa抑制活性方面的研究時發(fā)現(xiàn)，將TAP的第一位酪氨酸殘基替換為色氨酸，把第十位天冬氨酸替換為精氨酸，產(chǎn)生的TAP雙重突變體，可使其抗Xa的活性增加37倍。 血小板黏附和聚集

2、的一個重要成分是其表面的糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GpⅡb/Ⅲa)受體。研究發(fā)現(xiàn)apⅡb/Ⅲa與其配體的結(jié)合主要是通過構(gòu)象改變而識別其配體中的精氨酸—甘氨酸一天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)序列來完成的，通過基因工程或人工合成含有以上序列的多肽能抑制纖維蛋白原等配體與Gp Ⅱ b/Ⅲa受體的結(jié)合，從而具有抗凝作用。目前含RGD序列的多肽是臨床研究的熱點。 本研究采用環(huán)嫁接的方法，將RGDS(精氨酸—甘氨酸一天冬氨酸-絲氨酸)序

3、列在一定的構(gòu)象限制下導入TAP活性位點以外具有穩(wěn)定的β折疊指狀結(jié)構(gòu)的頂端。將此構(gòu)建的嵌合體基因在酵母表達系統(tǒng)中進行表達，以期獲得一種既有抗Xa的作用又有抑制血小板聚集功能(兼具纖溶酶激活功能)的雙功能、高效抗栓物質(zhì)。 首先參照天然TAP的氨基酸順序，設(shè)計將TAP的Y1的酪氨酸基因替換為色氨酸基因以及D10的天冬氨酸基因替換為精氨酸基因，產(chǎn)生雙重突變體TAP的基因序列。在編碼TAP指狀結(jié)構(gòu)的K30的賴氨酸和G31的甘氨酸之間插入編

4、碼RGDS氨基酸的基因序列。在5’及3’端分別加入EcoRI、NotI限制性酶切位點，全長共64個氨基酸殘基編碼序列共216個堿基。全基因分4個片段人工合成，并設(shè)計三個相應接頭。磷酸化后用T4-DNA連接酶16℃連接過夜。PCR擴增、膠回收后與PMD18-T質(zhì)粒連接，再轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a。質(zhì)粒抽提后用聚合酶鏈反應(Polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)特異性擴增TAP基因片段，膠回收、純化PCR反應產(chǎn)物后用限

5、制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI雙酶切并與同樣經(jīng)EcoRI和NotI雙酶切的pPIC9K真核表達載體連接，將連接產(chǎn)物再次轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a。篩選陽性克隆質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切，電泳及DNA測序鑒定，證實插入序列為目的基因序列。將篩選后的表達載體質(zhì)粒pPIC9K-TAP經(jīng)限制性內(nèi)切酶Sal Ⅰ酶切線性化后用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入感受態(tài)GS115酵母菌，得到的轉(zhuǎn)化子經(jīng)MD平板與MM平板、G418抗性篩選，PCR鑒定后，得到重組酵母工程菌GS115/pPI

6、C9K-TAP，用甲醇誘導分泌表達目標蛋白。經(jīng)SDS-PAGE分析后，將表達產(chǎn)物進行初步的分離純化后用正常人的血漿進行白陶土部分凝血酶原時間測定(APTT)和血漿凝血酶原時測定間(PT)試驗檢測產(chǎn)物抑制凝血酶活化的作用，采用血小板聚集試驗(platelet aggregation test，PAgT)檢測表達產(chǎn)物是否有結(jié)合血小板的活性。 研究結(jié)果：經(jīng)過酶切，PCR，序列分析證實成功構(gòu)建了含TAP-RGDS基因的重組分泌型表達質(zhì)粒

7、pPIC9K/TAP，重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化GS115酵母菌，并經(jīng)MD平板與MM平板、G418抗性篩選，及PCR鑒定后，得到重組酵母工程菌GS115/pPIC9K-TAP，用甲醇誘導分泌表達目標蛋白。經(jīng)SDS-PAGE分析，在標準分子量8kD左右有一條特異蛋白帶，說明培養(yǎng)上清中確有外源蛋白表達。表達產(chǎn)物進行抗凝血初步試驗，證明表達產(chǎn)物有抗凝血因子活性和抗血小板的作用。 研究結(jié)論： ①采用基因合成的方式成功構(gòu)建rTAP-RGDS的