HA-1077在內(nèi)皮誘導的大鼠骨髓基質(zhì)干細胞血管新生中的作用.pdf

1、[目的]
　　 ①建立大鼠主動脈環(huán)體外培養(yǎng)血管新生實驗模型，觀察新生血管生長的特征和規(guī)律。以Rho激酶抑制劑法舒地爾(HA-1077)為干預因素，研究HA-1077對血管新生的影響。②建立大鼠主動脈環(huán)與干細胞共培養(yǎng)血管新生實驗模型，研究經(jīng)內(nèi)皮定向誘導分化的大鼠骨髓基質(zhì)干細胞(BMSCs)對動脈環(huán)血管新生的影響，以及法舒地爾(HA-1077)的干預作用。
　　 [方法]
　　 1.HA-1077對體外培養(yǎng)大鼠主動脈

2、環(huán)血管新生的影響無菌條件下取一段胸主動脈，剪為長約1mm的血管環(huán)，隨機分為對照組、HA-1077低、中、高濃度組，對照組血管用HG-DMEM+15％FBS的培養(yǎng)液培養(yǎng)，HA-1077組分別在培養(yǎng)液中加入10μmol/L或30μmol/L或60μmol/L HA-1077，每2天換液，每天觀察微血管的生長情況。第5天終止實驗，拍攝微血管生長圖像，計數(shù)新生的微血管分支數(shù)。同組的血管環(huán)合并，組織勻漿，提取激酶，WesternBlot檢測ROC

3、KⅠ及ROCKⅡ的表達。
　　 2.大鼠主動脈環(huán)與同種異體、經(jīng)內(nèi)皮誘導的BMSCs體外共培養(yǎng)對血管新生的影響及HA-1077的干預作用2.1采用密度梯度離心法，用密度=1.077g/ml的淋巴細胞分離液，從大鼠骨髓中分離BMSCs，并于體外純化、擴增。流式細胞術檢測BMSCs的表面標志CD29、CD106以及CD45。
　　 2.2 EGM-2培養(yǎng)液誘導BMSCs10～14d，傳代后將誘導的BMSCs接種于明膠包被的玻片

4、，分別行Ⅷ因子免疫細胞化學和荊豆凝集素免疫熒光染色鑒定。
　　 2.3細胞增殖試驗：按2×103個/孔將內(nèi)皮誘導的BMSCs接種于96孔板培養(yǎng)24h，更換含刺激因子的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，采用MTT法，酶標儀490nm檢測OD值。每次實驗設平行孔4孔，實驗重復3次。
　　 2.4干細胞標記：PBS沖洗2遍，將1mL10mg/mL DiI加入到培養(yǎng)瓶中，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱內(nèi)孵育40分鐘，熒光顯微鏡觀察細胞的標記情況。消化細胞，制備成細

5、胞懸液，備用。
　　 2.5內(nèi)皮誘導的BMSCs與血管環(huán)共培養(yǎng)：無菌條件下取一段胸主動脈，剪為長約1mm的血管環(huán)，隨機分為空白對照組、實驗對照組、HA-1077低、中、高濃度組，空白對照組血管用HG-IDMEM+15％FBS的培養(yǎng)液培養(yǎng)，不加誘導的BMSCs；實驗對照組在空白對照組的基礎上，加誘導的BMSCs；HA-1077組，在實驗對照組的基礎上，并分別在培養(yǎng)液中加入10μmol/L，30μmol/L，60μmol/L HA-

6、1077。每2天換液，每天觀察微血管的生長情況。第10天終止實驗，拍攝微血管生長圖像，計數(shù)新生的微血管分支數(shù)。同組的血管環(huán)合并，組織勻漿，提取激酶，Western Blot檢測ROCKⅠ及ROCKⅡ的表達。
　　 [結(jié)果]
　　 1.HA-1077對體外培養(yǎng)大鼠主動脈環(huán)血管新生的影響與對照組比較，HA-1077低濃度組新生微血管數(shù)明顯增加，P<0.01；中、高濃度組新生微血管數(shù)較對照組明顯減少，P<0.01。對照組和HA

7、-1077低濃度組都有ROCKⅠ和ROCKⅡ表達，組間比較無明顯差異；HA-1077中、高濃度組則基本未見ROCKⅠ或ROCKⅡ表達。
　　 2.大鼠主動脈環(huán)與同種異體、經(jīng)內(nèi)皮誘導的BMSCs體外共培養(yǎng)對血管新生的影響及HA-1077的干預作用2.1 BMSCs培養(yǎng)2d后，部分貼壁細胞呈梭性，密度均一。7～9d后，貼壁細胞形成多個細胞集落。傳代后BMSCs體積較原代時明顯增大，呈長梭形，成纖維細胞樣。流式細胞術鑒定，CD106陽

8、性細胞達到38.9％，CD29陽性細胞為80.4％，CD45陽性細胞達到29.8％。
　　 2.2經(jīng)EGM-2誘導BMSCs10～14d后，細胞形態(tài)由長梭形向圓形、短梭形、多邊形轉(zhuǎn)變；細胞生長至融合后呈鵝卵石樣。內(nèi)皮細胞表面標志，Ⅷ因子和荊豆凝集素試驗陽性。
　　 2.3 MTT法檢測各組內(nèi)皮誘導的BMSCs增殖無顯著差異。
　　 2.4內(nèi)皮誘導的BMSCs與血管環(huán)共培養(yǎng)：與空白對照組比較，實驗對照組(只加誘導的

9、BMSCs組)新生微血管數(shù)明顯增加，P<0.01。與實驗對照組比較，低濃度組、中濃度組、高濃度組新生微血管數(shù)明顯減少，P<0.01。各組均有ROCKⅠ和ROCKⅡ表達，組間比較無明顯差異。
　　 [結(jié)論]
　　 1.小劑量的HA-1077促進體外培養(yǎng)的大鼠主動脈環(huán)的血管新生。大劑量的HA-1077抑制體外培養(yǎng)的大鼠主動脈環(huán)的血管新生，此作用與ROCK蛋白質(zhì)表達抑制有關。
　　 2.經(jīng)內(nèi)皮誘導的同種異體BMSCs與