基于重組慢病毒的新型HBV表型分析系統(tǒng).pdf

1、目的:以慢病毒系統(tǒng)為基礎(chǔ)，結(jié)合HBV聚合酶反式互補(bǔ)技術(shù)建立一種全新的HBV體外表型分析系統(tǒng)。
　　方法:
　　1.將HBV pol克隆到慢病毒載體pLenti-mcs，得到重組質(zhì)粒pLenti-pol，重組質(zhì)粒pLenti-pol與三種慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，產(chǎn)生HBV pol重組慢病毒，命名為L(zhǎng)enti-pol;
　　2.構(gòu)建pol基因表達(dá)缺失的HBV1.1倍體質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)兩個(gè)

2、月的G418篩選，獲得pol基因表達(dá)缺失的HBV1.1倍體穩(wěn)定細(xì)胞系，命名為HBV P-293;
　　3.利用反式互補(bǔ)，將重組慢病毒Lenti-pol導(dǎo)入到穩(wěn)定細(xì)胞系HBVP-293中，經(jīng)過(guò)10天殺稻瘟菌素(blasticidin)篩選之后，對(duì)獲得的細(xì)胞293HBV P-+P進(jìn)行HBV復(fù)制鑒定;
　　4.利用293HBV P-+P細(xì)胞，進(jìn)行野生型HBV藥物敏感性分析實(shí)驗(yàn);
　　5.構(gòu)建系列含有RT典型耐藥的HBV po

3、l重組慢病毒，通過(guò)反式互補(bǔ)，獲得可復(fù)制這些突變病毒的細(xì)胞系。
　　結(jié)果:
　　1.HBV pol重組慢病毒構(gòu)建成功;
　　2.成功構(gòu)建pol基因表達(dá)缺失的HBV1.1倍體穩(wěn)定細(xì)胞系;
　　3.將重組慢病毒Lenti-pol導(dǎo)入到穩(wěn)定細(xì)胞系HBV P-293中，HBVP-293能夠復(fù)制HBV DNA;
　　4.成功構(gòu)建一系列含有RT典型耐藥突變的HBV pol重組慢病毒，分別導(dǎo)入HBV P-293中，獲得相應(yīng)