PAMAM介導pCTGF-shRNA抑制小鼠腹膜纖維化的實驗研究.pdf

1、持續(xù)性非臥床腹膜透析(CAPD)是終末期腎病(ESRD)患者的主要替代治療之一。研究顯示，透析相關(guān)性腹膜纖維化導致的超濾衰竭(UFF)已經(jīng)逐漸成為CAPD患者退出的主要原因，極大地限制了腹膜透析的推廣應用。研究腹膜纖維化的發(fā)病機制和防治手段已成為維持腹膜透析持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。 腹膜纖維化是一個多細胞因子參與的病理生理過程，目前研究認為轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)在腹膜纖維化過程中為啟動和中樞作用，但由于其靶細胞種類繁多、效應復雜，

2、完全阻斷后果難以預料。而結(jié)締組織生長因子(CTGF)作為TGF-β的下游因子，介導了TGF-β部分的促纖維化效應，且作用單一，被認為是可能比TGF-β更理想的抗腹膜纖維化的靶目標。我們前期的研究已經(jīng)證實，以逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導的CTGF短發(fā)卡RNA(shRNA)，可明顯抑制TGF-β1誘導的人腹膜間皮細胞內(nèi)CTGF、血管內(nèi)皮生長因子及細胞外基質(zhì)的表達，對于腹膜纖維化具有潛在治療價值。但目前仍缺少以CTGF為靶點的、將RNA干擾(RNAi)

3、運用于腹膜纖維化動物模型的研究，同時逆轉(zhuǎn)錄病毒載體也存在隨機插入宿主序列的安全隱患。因此，在進一步尋找更有效的基因治療方法來抑制腹膜細胞CTGF的表達。 近年來，聚酰胺-胺型樹枝狀高聚物(PAMAM dendrimers)作為核酸、質(zhì)粒的運載體系逐漸得到重視。PAMAM是一種非病毒納米載體，具備無免疫原性、無遺傳毒性、轉(zhuǎn)染效率高、可長期穩(wěn)定表達等優(yōu)良特性，在DNA疫苗和基因治療領(lǐng)域具有良好的應用前景。但目前尚未見PAMAM攜帶s

4、hRNA抑制促纖維化因子的研究報道。因此構(gòu)建了一種表達CTGF-shRNA的質(zhì)粒，通過PAMAM的介導，轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的小鼠腹膜間皮細胞和小鼠腹膜纖維化模型，觀察其對腹膜間皮細胞和腹膜組織CTGF表達以及纖維化的影響。 本文分為三部分，第一章構(gòu)建表達CTGF-shRNA的pGenesil-1質(zhì)粒，第二章應用PAMAM載體介導pCTGF-shRNA干擾原代培養(yǎng)的小鼠腹膜間皮細胞，第三章應用PAMAM載體介導pCTGF-shRNA干擾

5、小鼠腹膜纖維化模型。 目的：構(gòu)建表達小鼠CTGF-shRNA的pGenesil-1質(zhì)粒(pCTGF-shRNA)，通過PAMAM納米載體介導，分別轉(zhuǎn)染小鼠腹膜間皮細胞和小鼠腹膜纖維化模型，研究其對于腹膜間皮細胞和腹膜組織的CTGF、TGF-β1及FN表達的影響。 方法： 1．應用生物信息學方法，參考shRNA的設(shè)計策略，設(shè)計2條靶序列mCTGFl和mCTGF2以及一條陰性對照HK。分別與pGenesil-1質(zhì)粒連

6、接，構(gòu)建相應的3個質(zhì)粒pCTGF1-shRNA、pCTGF2-shRNA和pHK-shRNA，并通過酶切和測序等方法進行鑒定。檢測PAMAM G9/DNA(質(zhì)粒)復合物的物化特性。 2．采用胰蛋白酶消化法從小鼠腹膜組織中分離腹膜間皮細胞進行體外培養(yǎng)，應用PAMAM G9將pCTGF1-shRNA、pCTGF2-shRNA和pHK-shRNA質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染高糖(4.25％葡萄糖)刺激下的第3代小鼠腹膜間皮細胞。采用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈式反

7、應(RT-PCR)半定量分析檢測細胞CTGF、TGF-β1和FN基因的轉(zhuǎn)錄水平，采用Western Blot檢測相應蛋白質(zhì)的表達水平。 3．將昆明小鼠隨機分為轉(zhuǎn)染組和對照組，分別經(jīng)腹腔注射PAMAM G9/pHK-shRNA復合物或生理鹽水，于24h、48h、96h和7d留取壁層和臟層腹膜組織，制作冰凍切片，在熒光顯微鏡下觀察壁層腹膜綠色熒光蛋白的表達情況，同時采用Western Blot檢測臟層腹膜綠色熒光蛋白的表達。

8、 4．將C57BL/6小鼠隨機分為CTGF干擾組、HK轉(zhuǎn)染組、腹膜纖維化模型組和正常對照組4組，分別給予相應處理28天后，留取壁層和臟層腹膜組織。應用Masson染色檢測壁層腹膜厚度，采用RT-PCR半定量分析檢測各組腹膜組織CTGF、TGF-β1和FN基因的轉(zhuǎn)錄水平，采用Western Blot和免疫組化檢測相應蛋白質(zhì)的表達水平。 結(jié)論： 1．PAMAM載體可介導pCTGF1-shRNA、pCTGF2-shRNA轉(zhuǎn)染原