雙氫睪酮對Aβ誘導的突觸后致密區(qū)損傷的保護作用及分子機制研究.pdf

1、背景:
　　阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是老年期癡呆癥中最常見的一種類型，臨床以進行性認知功能減退為主要特征。多項研究證明突觸喪失程度與癡呆及早期AD分期最好的相關性，突觸喪失是AD早期發(fā)病過程中一個突出的病理學改變，在老年斑塊形成之前即可導致認知功能減退，是AD患者學習記憶功能減退的病理學基礎，與認知功能減退有較好的相關性。
　　大量研究結果顯示，可溶性的β淀粉樣蛋白(amyloidβ，Aβ

2、)寡聚體可以導致認知功能減退，尤其是在發(fā)病的早期階段。動物研究中，Aβ寡聚體可以引起快速學習障礙、包括突觸可塑性在內的突觸機制障礙以及突觸后膜的突觸后致密區(qū)(post-synaptic density，PSD)結構的損傷。PSD是突觸后膜上的關鍵性功能區(qū)，參與突觸前、后大量分子聯系與突觸功能調控，因此是突觸的關鍵結構與功能單位之一。
　　在分子水平上，PSD是由突觸后致密蛋白-95(post-synaptic densitypro

3、tein-95，PSD-95)、Homer-1、Shank等蛋白分子為核心分子構筑的突觸后膜關鍵結構單元。PSD的發(fā)育與神經元突觸(synapse)、樹突棘(spine)發(fā)育呈現正相關聯系。PSD結構與功能的異常直接影響神經元突觸的發(fā)育與功能狀態(tài)。因此，探討Aβ對PSD的關鍵結構分子PSD-95、Homer-1等蛋白分子表達的影響，對我們進一步闡明AD突觸損傷機制、改善AD患者認知功能障礙有重要的意義。
　　同時，隨著年齡的增長，

4、腦中亦存在雄激素水平的下降，在影響骨密度、性功能的同時，大腦功能，如情緒、認知和記憶也受到一定的影響，包括阿爾茨海默病在內的年齡相關的神經退行性疾病也與雄激素的下降有關。在成年動物體內，雄激素與神經元可塑性以及海馬CA1區(qū)樹突棘突觸密度的調節(jié)有關。因此我們推測，雄激素可能存在重要的突觸保護作用。
　　先前的研究發(fā)現，PI3K/Akt、MAPK/ERK信號通路對神經元突觸結構與功能活動具有關鍵性調節(jié)作用。而近年來也發(fā)現，雄激素可以激

5、活神經元或膠質細胞的PI3K/Akt、MAPK/ERK信號通路而發(fā)揮神經保護作用。因此，通過探索雄激素對大腦神經元突觸結構與功能可能存在的保護作用及其機制，或可為阿爾茨海默病等突觸受損疾病的防治提供臨床和藥理借鑒，具有重要的潛在應用價值。
　　目的:
　　采用神經母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)作為神經元體外研究模型，觀察Aβ對突觸后致密區(qū)的損傷作用，并進一步探討雙氫睪酮(dihydrotestosterone，DHT)可能存

6、在的對抗Aβ而產生的突觸保護作用及PI3K/Akt、MAPK/ERK通路在其突觸保護過程中的作用，為雄激素預防或治療阿爾茨海默病(AD)提供理論依據。
　　方法:
　　1.Aβ對SH-SY5Y神經元PSD蛋白分子表達及PI3K/Akt、MAPK/ERK信號通路的影響
　　1.1Aβ對SH-SY5Y細胞PSD蛋白表達的影響
　　分別設不同濃度梯度的Aβ142、Aβ25-35作用組，采用western-blot法檢測

7、其對PSD-95、Homer-1蛋白表達的影響。
　　1.2Aβ對SH-SY5Y細胞PI3K/Akt、MAPK/ERK信號通路的影響
　　分別設不同濃度梯度的Aβ1-42、Aβ25-35處理組，采用western-blot法檢測其對p-Akt、p-ERK1/2的磷酸化激活的影響。
　　2.DHT對SH SY5Y神經元PSD蛋白分子表達及PI3K/Akt、MAPK/ERK信號通路的影響
　　2.1DHT對SH-SY

8、5Y神經元PSD蛋白表達的影響
　　不同濃度梯度的DHT作用組，采用western-blot法檢測PSD-95、Homer-1蛋白的表達變化。
　　2.2DHT對SH-SY5Y神經元PI3K/Akt、MAPK/ERK信號通路的影響
　　不同濃度梯度的DHT作用于SH SYSY細胞，western-blot法檢測p-Akt、p-ERK1/2的磷酸化水平變化。
　　3.DHT對Aβ1-42、Aβ25-35誘導的PSD

9、結構蛋白表達下調的影響及分子機制
　　Western-blot方法觀察DHT對Aβ1-42、Aβ25-35處理后的PSD-95、Homer-1蛋白表達的影響，并觀察PI3K/Akt阻斷劑LY294002、MAPK/ERK阻斷劑U0126對DHT作用的影響。
　　4.Aβ1-42、Aβ25-35及DHT對神經元及突觸后致密區(qū)(PSD)結構的形態(tài)學影響
　　采用Homer-1間接免疫熒光方法，共聚焦顯微鏡觀察Aβ1-42、

10、Aβ25-35或/和DHT處理后神經元突觸結構（包括細胞突起數量、突起長度及突觸連接和突觸PSD）的形態(tài)學變化。
　　結果:
　　1.Aβ1-42、Aβ25-35以濃度依賴的方式下調PSD蛋白分子PSD-95、Homer-1的表達;而且，Aβ1-42、Aβ25-35還可以濃度依賴性地抑制Akt及ERK的磷酸化激活。
　　2.DHT以濃度依賴的方式上調支架蛋白PSD-95、Homer-1的表達，同時還可以濃度依賴性地促進

11、Akt及ERK的磷酸化激活。
　　3.DHT可以明顯抑制Aβ142、Aβ2535誘導的神經元突觸PSD-95、Homer-1表達下調作用，而PI3K抑制劑LY294002及MEK抑制劑U0126可明顯抑制DHT的抗Aβ1-42、Aβ2535突觸蛋白下調的保護作用。
　　4.共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現，Aβ1-42、Aβ25-35寡聚體分別處理后的神經元細胞突起數量減少、突起長度明顯縮短，細胞間突觸連接大大減少;而DHT預處理后，A

12、β1-42、Aβ25-35誘導的神經元突觸損傷效應明顯受到抑制。
　　結論:
　　1.在體外SH-SY5Y神經元模型上，我們發(fā)現，Aβ1-42、Aβ25-35可以明顯下調PSD支架蛋白PSD-95、Homer-1的表達;同時，Aβ1-42、Aβ25-35也可以明顯抑制神經元Akt及ERK1/2的磷酸化激活，進一步抑制PI3K/Akt及MAPK/ERK信號通路。
　　2.在體外SH-SY5Y神經元模型上，DHT可以明顯抑

13、制Aβ1-42、Aβ25-35誘導的PSD支架蛋白PSD-95、Homer-1表達下調;同時，DHT可以明顯促進神經元Akt及ERK1/2的磷酸化激活，進一步激活PI3K/Akt及MAPK/ERK信號通路;此外，PI3K抑制劑LY294002及MEK抑制劑U0126可明顯抑制DHT的抗Aβ1-42、Aβ25-35突觸蛋白下調作用。因此，我們推測，DHT可能通過激活PI3K/Akt及MAPK/ERK信號通路而產生抗Aβ142、Aβ25-3