重組類絲狀蛋白的制備與應(yīng)用探討.pdf

1、絲素蛋白是一種源于蠶絲的纖維蛋白，由于其優(yōu)良的理化性質(zhì)和生物相容性，絲素蛋白纖維除了應(yīng)用于傳統(tǒng)的紡織領(lǐng)域外，人們越來越多地關(guān)注其在生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域的應(yīng)用。本研究利用基因重組技術(shù)把含有短肽RGD(精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸)的序列連接到桑蠶絲素蛋白的結(jié)晶序列GAGAGS上，形成具有[TGRGDSPA(GVPGV)2GG(GAGAGS)3AS]n(簡稱為Silk-RGD)一級結(jié)構(gòu)的桑蠶絲素-RGD融合蛋白質(zhì)，以期源于桑蠶絲素蛋白的序列在經(jīng)過材

2、料的加工成型后形成結(jié)構(gòu)區(qū)，主要提供材料的力學(xué)性能，而含短肽RGD的序列形成功能區(qū)，主要提供材料的細胞粘附性能。利用重組技術(shù)和發(fā)酵技術(shù)，我們成功地合成了具有分子量38kDa的重組類絲狀Silk-RGD(8)融合蛋白。細胞粘附性分析結(jié)果顯示，融合蛋白對小鼠成纖維細胞BALB/3T3的增殖性能與天然膠原蛋白相近，且表現(xiàn)出了比膠原蛋白更好的細胞粘附性能。為了能夠獲得大量具有一定純度的融合蛋白原料，克服親和層析速度慢、成本高的缺點，本研究根據(jù)Si

3、lk-RGD融合蛋白的特點，探索一種簡便、經(jīng)濟、快速的硫酸銨鹽析法提純工藝。研究發(fā)現(xiàn)，Silk-RGD(8)融合蛋白的等電點為pH8，相對合理而且易操作的鹽析純化條件為：pH8，硫酸銨在溶液中的飽和度為20﹪，室溫(約20℃)。在此鹽析條件下獲得的重組類絲狀蛋白的純度約為70﹪，每升培養(yǎng)基可獲得重組蛋白濕重為8.4 g左右。為了探索該重組蛋白可能的應(yīng)用領(lǐng)域，本研究首先以天然絲素蛋白為原料進行了多孔支架材料的研制。在絲素蛋白溶液中添加有機

4、溶劑，并結(jié)合凍干法制備了多孔支架材料，通過對其溶脹性、孔隙率、壓縮強度、壓縮模量以及二級結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變和表面構(gòu)造的分析發(fā)現(xiàn)，絲素支架材料可以達到80﹪以上的孔隙率，孔與孔之間貫通性較好，支架材料擁有較好的壓縮強度以及壓縮彈性。 本研究利用基因重組技術(shù)合成了功能性類絲狀蛋白質(zhì)材料，通過對其鹽析工藝條件的探索，為其大量制備提供了保證。同時，以天然絲素蛋白為模板，研究了多孔支架材料的制備方法，從而為進一步利用重組類絲狀蛋白來開發(fā)和制備多孔支