HBeAg影響人胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞TLR3-4表達(dá)效應(yīng)及其在母嬰傳播中作用機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)是一種肝向性DNA病毒,嚴(yán)重威脅人類的健康。孕婦感染HBV后,可能經(jīng)胎盤垂直傳播給胎兒,引起宮內(nèi)感染,是我國(guó)人群HBV傳播的重要途徑。乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)是HBV的一種輔助蛋白,并不參與病毒的復(fù)制和組裝。HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎(CHB)孕婦常持續(xù)感染HBV,并導(dǎo)致宮內(nèi)感染。研究發(fā)現(xiàn),HBeAg能抑制CHB患者的肝細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞

2、和Kupffer細(xì)胞Toll樣受體2(TLR2)表達(dá)及其介導(dǎo)的天然免疫反應(yīng),相似的是,在HBeAg陽(yáng)性CHB患者的外周血樹突狀細(xì)胞Toll樣受體3(TLR3)表達(dá)減少。此提示,HBeAg在病毒感染過(guò)程中可能起免疫調(diào)節(jié)作用,促進(jìn)病毒持續(xù)感染。
　　 Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是一種近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的模式識(shí)別受體,可識(shí)別和應(yīng)答病原體相關(guān)分子模式(PAMPs),在抵御各種病原微生物的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重

3、要作用。天然免疫系統(tǒng)是機(jī)體抗病原體感染的第一道防線,TLRs家族是其中重要的組成部分。
　　 TLRs可廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物的組織和細(xì)胞中。至今,已發(fā)現(xiàn)和鑒別了10種人屬TLRs,在人胎盤組織均可表達(dá),TLR3、TLR4主要表達(dá)于胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞。TLRs信號(hào)傳導(dǎo)包括2條途徑:MyD88依賴性和非依賴性途徑,TLR3信號(hào)傳導(dǎo)主要通過(guò)MyD88非依賴的TRIF途徑,而TLR4主要通過(guò)MyDS8依賴性或非依賴性途徑傳導(dǎo)信號(hào)。TZR3、T

4、LR4可介導(dǎo)抑制肝臟細(xì)胞、外周血樹突狀細(xì)胞中HBV復(fù)制。TLR3可識(shí)別病毒雙鏈RNA(dsRNA)并發(fā)生免疫應(yīng)答,滋養(yǎng)層細(xì)胞在TLR3的配體多聚肌胞(polyI:C)處理后可產(chǎn)生Ⅰ型干擾素(IFN-α/β),而IFN-β是由TLR3誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生的主要細(xì)胞因子；以TLR4的配體脂多糖(LPS)刺激絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞可產(chǎn)生前炎癥細(xì)胞因子(如TNF-α)和趨化因子(如IL-8)。此提示,胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞可能通過(guò)TLR3、TLR4識(shí)別病毒相關(guān)分子模式

5、并觸發(fā)抗病毒反應(yīng)。
　　 胎盤作為一種特殊的物理和免疫屏障,在防御不同微生物的侵襲中起重要作用。胎盤屏障的第一層細(xì)胞是滋養(yǎng)層細(xì)胞,該層細(xì)胞直接與母親血液接觸,可識(shí)別病原微生物并對(duì)其作出相應(yīng)的免疫應(yīng)答。因此,滋養(yǎng)層細(xì)胞在防御HBV宮內(nèi)感染中可能發(fā)揮重要的作用。
　　 但是,關(guān)于HBeAg陽(yáng)性CHB孕婦持續(xù)感染HBV并導(dǎo)致宮內(nèi)感染的機(jī)制尚不清楚。Bewo細(xì)胞是一種人胎盤絨毛癌細(xì)胞系,現(xiàn)已被廣泛用于滋養(yǎng)層細(xì)胞功能的研究。本研究

6、擬分別構(gòu)建1.3倍HBV基因組及HBeAg的真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染Bewo細(xì)胞,建立HBV和HBeAg表達(dá)的細(xì)胞模型,并以此研究HBeAg對(duì)人胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞TLR3/4的表達(dá)及其生物效應(yīng)的影響,探討胎盤HBV持續(xù)感染并垂直傳播給胎兒的機(jī)制,為防治HBV宮內(nèi)感染提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方 法
　　 1.HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎孕婦胎盤組織TLR3、TLR4的表達(dá)及意義:選取22例HBeAg陽(yáng)性和24例HBeAg陰性C

7、HB孕婦,及正常孕婦25例。建立實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)胎盤組織中TLR3、TLR4 mRNA水平,同時(shí)以免疫組化法檢測(cè)其在胎盤組織中的表達(dá),并采用熒光定量PCR(FQ-PCR)和微粒子酶免疫分析法(MEIA)分別定量檢測(cè)其血清HBV DNA和HBeAg水平。
　　 2.TLR3、TLR4介導(dǎo)的天然免疫對(duì)Bewo細(xì)胞中HBV復(fù)制的作用:以質(zhì)粒pMD18T-HBV上的HBV DNA序列為模板,構(gòu)建1.3倍HBV全基因序列基因,

8、將其插入到真核表達(dá)載體peDNA3.1(+),用酶切、PCR及測(cè)序鑒定,并把該載體轉(zhuǎn)染Bewo細(xì)胞,以Western免疫印跡、MEIA和FQ-PCR分別檢測(cè)胞內(nèi)和上清中HBsAg、HBeAg的表達(dá)及HBV DNA水平。以RT-PCR和ELISA分別檢測(cè)細(xì)胞TRIF、MyD88 mRNA表達(dá)及其上清IFN-β、IFN-α水平。
　　 3.HBeAg對(duì)Bewo細(xì)胞TLR3、TLR4表達(dá)及其生物效應(yīng)的影響:用PCR方法從質(zhì)粒pMD18

9、T-HBV中擴(kuò)增HBeAg基因,克隆到peDNA3.1(+),構(gòu)建真核表達(dá)載體peDNA3.1(+)-HBe,通過(guò)酶切、PCR及測(cè)序鑒定,并把該載體轉(zhuǎn)染Bewo細(xì)胞,用Western免疫印跡和MEIA檢測(cè)胞內(nèi)和上清中HBeAg的表達(dá)。以FQ-PCR和ELISA分別檢測(cè)細(xì)胞TLR3、TLR4 mRNA表達(dá)及細(xì)胞上清IFN-β、IFN-α水平,并采用免疫熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞NF-κBp65核轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　 結(jié) 論
　　 1.HB

10、eAg陽(yáng)性CHB孕婦血清HBeAg持續(xù)高表達(dá),且其宮內(nèi)感染率顯著高于正常及HBeAg陰性孕婦,但胎盤組織TLR3、TLR4的mRNA、蛋白水平表達(dá)均顯著低于其余兩組；胎盤組織中TLR3、TLR4 mRNA表達(dá)與HBeAg水平呈負(fù)相關(guān)。此提示,HBeAg陽(yáng)性CHB孕婦宮內(nèi)感染HBV與TLR3、TLR4低表達(dá)關(guān)系密切,其對(duì)胎盤TLR3、TLR4表達(dá)可能起負(fù)調(diào)節(jié)作用。
　　 2.成功構(gòu)建了1.3倍HBV全基因真核表達(dá)載體pcDNA3.

11、1(+)-HBV1.3,為研究HBV宮內(nèi)感染的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。通過(guò)誘導(dǎo)Bewo細(xì)胞產(chǎn)生IFN-β和TNF-α,TLR3、TLR4介導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答可抑制HBV復(fù)制,但隨著HBV感染量的增大,其對(duì)HBV復(fù)制的抑制作用顯著下降。TLR3介導(dǎo)抑制Bewo細(xì)胞中HBV復(fù)制主要呈TRIF依賴性,而TLR4主要依賴于調(diào)節(jié)蛋白MyD88。此提示,激活TLR3、TLR4可能成為一種新穎和有效防治HBV宮內(nèi)感染的方法。
　　 3.成功構(gòu)建了HBe

12、Ag真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-HBe,為研究?jī)?nèi)源性HaeAg對(duì)Bewo細(xì)胞TLRs表達(dá)的作用奠定了基礎(chǔ)。polyI:C和LPS可顯著誘導(dǎo)Bewo細(xì)胞TLR3、TLR4 mRNA表達(dá),且可通過(guò)IFN-β自分泌反饋誘導(dǎo)TLR3表達(dá)。HBeAg通過(guò)下調(diào)細(xì)胞TLR3、TLR4 mRNA的表達(dá),抑制NF-κB激活和細(xì)胞因子產(chǎn)生,從而干擾Bewo細(xì)胞的免疫功能。此提示,HBeAg下調(diào)胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞TLR3和TLR4表達(dá)效應(yīng)可能是引起HBV

13、宮內(nèi)感染的一個(gè)重要的因?yàn)椤?br>　　 主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)
　　 1.成功構(gòu)建了1.3倍HBV全基因真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-HBV1.3,建立了新型的滋養(yǎng)層細(xì)胞HBV表達(dá)模型,為研究HBV宮內(nèi)感染奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.成功構(gòu)建了HBeAg真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-HBe,建立了滋養(yǎng)層細(xì)胞HBeAg表達(dá)模型,為研究胞內(nèi)HBeAg對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞TLRs表達(dá)及其生物效應(yīng)的影響提供了一個(gè)良好的平臺(tái)。