脂質(zhì)沉積性肌病的臨床、生化、分子病理和藥物治療研究.pdf

1、代謝性肌病是一組常被臨床誤診的骨骼肌疾病，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，需要進行病理學(xué)、生化代謝和酶學(xué)檢查加以確診。骨骼肌是一個需要大量能量持續(xù)供應(yīng)的器官，肌纖維內(nèi)糖原和脂肪酸是分別是肌肉短期和長期主要能量來源，因此糖元代謝和脂肪酸代謝異常會導(dǎo)致以肌病為主的全身多系統(tǒng)代謝紊亂，并且許多遺傳性或獲得性骨骼肌疾病都與糖元和脂肪酸代謝異常有關(guān)。近年來病理、生化和分子診斷方法的普及應(yīng)用，大大提高了代謝性肌病的確診率。本研究主要對脂肪酸代謝異常引起的肌病，包

2、括核黃素反應(yīng)性脂質(zhì)沉積性肌病和單純肌病型中性脂肪貯積癥這兩種主要的脂質(zhì)沉積性肌病進行臨床，病理，生化，分子和治療手段的深入探討。
　　 脂質(zhì)沉積性肌病(Lipidstoragemyopathy,LSM)，是由于脂肪代謝過程中多種酶的功能缺陷或肉堿的缺乏，影響了肌纖維內(nèi)的脂肪酸代謝，導(dǎo)致異常增多的脂滴在肌纖維內(nèi)堆積而引起一組病理綜合征[1]。LSM不是一個獨立的疾病實體，是一組由多種脂肪代謝缺陷所致的疾病的統(tǒng)稱。該組疾病主要有兩種

3、表現(xiàn)形式，一是光鏡下可見肌纖維內(nèi)有大量的脂滴沉積，臨床表現(xiàn)為進行性肌肉無力和運動不耐受，即指的“脂質(zhì)沉積性肌病”[2];另一種是肌纖維內(nèi)罕見脂滴沉積，而臨床主要表現(xiàn)為運動、饑餓或感染等應(yīng)激條件下誘發(fā)的反復(fù)發(fā)作的急性橫紋肌溶解，或者僅表現(xiàn)為慢性持續(xù)性的肌無力[3]。至今國內(nèi)文獻已有大量LSM病例報道。與其他國家相比，本病在我國的發(fā)病率較高，國外LSM報告較少[4]，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于我國的比例。
　　 目前LSM的病因主要包括三大類[5]:

4、①原發(fā)性肉堿缺乏(Primarycarnitinedeficiency，PCD);②多種酰基脫氫缺陷(MultipleacylCoAdehydrogenationdeficiency，MADD)，即戊二酸尿癥Ⅱ型(GlutaricaciduriatypeⅡ，GAII);③細(xì)胞漿內(nèi)甘油三酯代謝障礙，包括三酰甘油水解過程的上游水解酶PNPLA2基因（又稱ATGL的基因）突變導(dǎo)致的單純肌病型中性脂肪貯積癥(Neutrallipidstorag

5、ediseasewithmyopathy，NLSDM)[6]以及由ATGL的活化蛋白CGI-58基因（又稱ABHD5基因）突變導(dǎo)致的中性脂肪貯積癥伴魚鱗病(Neutrallipidstoragediseasewithichthyosis，NLSDI)，后者又稱Chanarin-Dorfman綜合征。此外，部分肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶Ⅱ（Carnitinepalmitoyltransferase，CPT(II)）缺乏的患者也表現(xiàn)為LSM[5]。<

6、br>　　 本文主要探討我國兩種主要的LSM(MADD和NLSDI)的臨床特點、生化和病理診斷、分子機制及其治療手段。本研究不僅對代謝性肌病的診斷和治療具有重大提示作用，還有利于遺傳性肌病患者的優(yōu)生優(yōu)育，同時有助于探索核黃素在能量代謝障礙性疾病和神經(jīng)退行性疾病中的潛在治療作用。
　　 第一部分脂質(zhì)沉積性肌病患者的臨床、病理和生化分析
　　 本研究選取1995-2011年間來齊魯醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科就診的64例LSM患者。所有患

7、者均行肌肉組織冰凍病理檢查，24例患者采集適量新鮮尿液，29例患者取無名指末梢血，分別行尿有機酸和血脂酰肉堿生化分析。本研究所采用的正常對照系因肌無力行肌肉活檢，而實驗室檢查和肌肉病理診斷為大致正常的個體。
　　 根據(jù)患者臨床表現(xiàn)、肌肉病理、生化分析和核黃素治療的效果，這些患者分兩組。第一組:61例患者臨床表現(xiàn)為單純近端為主的對稱性肌無力和運動不耐受，伴有不同程度高肌酸激酶(Creatinekinase，CK)血癥和肌痛，但是沒

8、有發(fā)作性腦病及其他臟器受累的癥狀和體征。病理染色見大量脂滴在肌纖維內(nèi)沉積[2]，以Ⅰ型纖維為主。患者發(fā)作期尿有機酸分析發(fā)現(xiàn)異常增多的二羧酸，乙基丙二酸，2-羥基戊二酸;?；鈮A分析顯示中長鏈?；鈮A明顯增高。其中41例LSM患者采用單一核黃素（維生素B2）治療后肌無力癥狀明顯改善（稱為核黃素反應(yīng)性LSM）[7]。第二組:另外3例雖然也表現(xiàn)為單純性肌無力和運動不耐受，但是近端肌群不如遠(yuǎn)端肌群受累明顯，并且存在受累肌群的不對稱性?；颊呋顧z標(biāo)

9、本除脂滴沉積外，局部可見鑲邊空泡[4，8]。尿有機酸和血脂酰肉堿分析大致正常。對組二3例單純肌病型中性脂肪貯積癥的患者，進一步抽取外周血涂片行病理染色檢查，在所有患者外周血白細(xì)胞內(nèi)均可見脂肪增多，即Jodan陽性。
　　 第二部分脂質(zhì)沉積性肌病的基因突變分析
　　 為了找出本組患者的致病基因，我們對全部64例LSM患者進行候選基因分析。PCR擴增LSM相關(guān)基因ETFDH(Electrontransferflavoprot

10、eindehydrogenase),ETFA(Electrontransferflavoprotein,αsubunit),ETFB(Electrontransferflavoprotein,βsubunit),ACADM(Acyl-CoAdehydrogenases,medium-chain),PNPLA2(Patatin-likephospholipasedomain-containingprotein2)和MFT(Mitochon

11、drialfolatetransporter)的所有外顯予以及內(nèi)含子外顯子交界區(qū)，并做序列分析。對于基因組PCR未發(fā)現(xiàn)突變者，再進一步提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后行cDNA全長擴增和測序。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，臨床表現(xiàn)為核黃素反應(yīng)性LSM的61例患者，有57例帶有ETFDH基因突變，符合MADD的分子診斷。并且ETFDH基因突變形式多樣，以復(fù)合雜合突變?yōu)橹?，突變位點多位于蛋白的黃素腺嘌呤二核苷酸(Flavinadeninedinucleo

12、tide，F(xiàn)AD)結(jié)合域，突變?nèi)巳捍嬖?個熱點突變，為c.770A＞G和c.1227A＞C，出現(xiàn)頻率分別為21次和15次。其余4例核黃素反應(yīng)性LSM未發(fā)現(xiàn)相關(guān)候選基因的突變;臨床表現(xiàn)為遠(yuǎn)端不對稱受累為主的3例脂質(zhì)沉積性肌病患者，全部攜帶PNPLA2基因突變，符合單純肌病型中性脂肪貯積癥的分子診斷。
　　 同時對患者ETFDH基因突變熱點c.770A＞G和c.1227A＞C進行單體型連鎖分析。根據(jù)軟件計算結(jié)果，c.770A＞G不屬

13、于任何一個單體型塊(haplotypeblock)，即使存在奠基者，在遺傳過程中該區(qū)域發(fā)生的基因重組頻率太高，無法進行連鎖不平衡的計算;c.1227A＞C突變的分析結(jié)果未證實存在奠基者效應(yīng)(foundereffect)
　　 第三部分核黃素反應(yīng)性脂質(zhì)沉積性肌病的突變蛋白ETF:QO對其輔基FAD和CoQ10的影響
　　 電子轉(zhuǎn)運黃素蛋白（Electrontransferflavoprotein，ETF）接受上游脂肪酸氧化

14、脫氫反應(yīng)產(chǎn)生的電子，然后電子在輔基FAD的幫助下傳遞給電子轉(zhuǎn)運黃素蛋白泛醌氧化還原酶(Electrontransferflavoproteinubiquinoneoxidoreductase，ETF:QO)，通過輔酶Q10(CoenzymeQ10，CoQ10)而進入呼吸鏈，最終與氧結(jié)合生成水[9，10]。
　　 為了進一步明確ETFDH基因突變的分子特點，對其中17例ETFDH基因突變LSM患者進行突變蛋白ETF:QO的免疫印跡

15、分析，并將突變患者的ETF:QO蛋白表達量與正常對照相比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LSM患者體內(nèi)ETF:QO蛋白的表達量僅有輕度下降。
　　 既然突變沒有導(dǎo)致蛋白表達量的減少，因此突變是如何影響脂肪酸的代謝過程，還是值得我們進一步深入研究的。為了探討ETF:QO蛋白突變導(dǎo)致的分子病理過程，我們采用免疫沉淀法分離10例ETFDH基因突變患者的ETF:QO蛋白，進而對沉淀的ETF:QO蛋白和與之共同被沉淀出的輔基FAD進行分別定量，計算兩者的結(jié)合

16、率，并與正常對照比較，觀察ETF:QO突變對FAD輔基結(jié)合能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)核黃素反應(yīng)性LSM患者體內(nèi)FAD與ETF:QO蛋白的結(jié)合率明顯低于正常對照。而肌肉內(nèi)總的FAD水平與正常對照相比無明顯差異。說明ETFDH基因突變會導(dǎo)致FAD與ETF:QO蛋白的結(jié)合力減弱，而非肌肉內(nèi)總體FAD水平的缺陷。
　　 目前已發(fā)表的文獻對LSM患者肌肉CoQ10含量尚有爭議[6，11，12]。為了闡明突變蛋白對下游電子傳遞受體CoQ10的影響

17、，我們采用反相高效液相色譜法(High-performanceliquidchromatography,HPLC)對34例ETFDH基因突變患者骨骼肌CoQ10含量進行定量分析，以便進一步闡明該病的病理機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用肌肉總重量和總蛋白作內(nèi)參，ETFDH基因突變患者肌肉內(nèi)CoQ10水平高于正常對照(p＜0.001)，分別為正常對照的1.92和1.64倍;而采用檸檬酸合酶做內(nèi)參，ETFDH基因突變患者肌肉CoQ10水平與正常對照無統(tǒng)計學(xué)

18、差異。說明前面兩種數(shù)據(jù)的升高是因為肌肉內(nèi)線粒體拷貝數(shù)升高導(dǎo)致的假象，而檸檬酸合酶是線粒體的標(biāo)志性酶，以它作內(nèi)參的結(jié)果，說明每一個線粒體內(nèi)的CoQ10水平未發(fā)生明顯變化。為了證實患者體內(nèi)的線粒體拷貝數(shù)的變化，采用實時熒光定量PCR來測定肌纖維內(nèi)線粒體DNA(MitochondrialDNA，mtDNA)相對于核DNA(NuclearDNA,nDNA)的表達量。結(jié)果證實18例ETFDH基因突變患者的mtDNA含量明顯高于同年齡性別對照。同時

19、我們還檢測了CoQ10合成相關(guān)基因的mRNA表達量。CoQ10合成相關(guān)的編碼基因表達量未見明顯改變，而代謝調(diào)節(jié)因子過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisomeproliferator-activatedreceptors，PPARs)基因的表達量有明顯升高。
　　 第四部分β受體激動劑對單純肌病型中性脂肪貯積癥患者成纖維細(xì)胞內(nèi)脂滴沉積的治療作用
　　 單純肌病型中性脂肪貯積癥(Neutrallipidstoraged

20、iseasewithmyopathy，NLSDM)是一種少見的常染色體隱性遺傳病，由PNPLA2基因(Patatin-likephospholipasedomain-containingprotein2，又稱CGI-58基因)突變導(dǎo)致脂肪甘油三酯脂肪酶（Aadiposetriglyceridelipase，ATGL，又稱Desnutrin）功能缺陷從而引起的脂肪代謝性肌病。
　　 有報道，在體外用β腎上腺素受體激動劑干預(yù)患者成纖

21、維細(xì)胞，可以激活激素敏感性甘油三酯脂肪酶(hormone-sensitivelipase，HSL)，由此可以部分代償并緩解PNPLA2缺陷所致的脂肪分解功能障礙。Formoterol是美國FDA批準(zhǔn)的可用于臨床治療哮喘的長效β腎上腺素受體激動劑藥物，為了觀察該藥物治療前后肌纖維內(nèi)的脂滴在PNPLA2基因突變患者和正常對照的變化，我們用Formoterol體外干預(yù)患者的成纖維細(xì)胞，然后進行PDA(1-pyrenedecanoicacid)

22、對脂滴的熒光標(biāo)記示蹤實驗和Nilered，Bodipy熒光染色對比實驗，并且采用酶化學(xué)反應(yīng)法紫外分光光度計測量藥物干預(yù)后成纖維細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(Triglyceride，TAG)的含量。貝特類的降脂藥物通過激活PPARα信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)外周組織如肝臟、骨骼肌的脂質(zhì)代謝，降低周圍循環(huán)中的脂質(zhì)含量，臨床用來治療高脂血癥。因此，在觀察長效β腎上腺素受體激動劑藥物療效的同時，我們設(shè)置了一組苯扎貝特藥物干預(yù)的平行對照，以觀察不同作用靶點的藥物對P

23、NPLA2基因突變患者成纖維細(xì)胞內(nèi)TAG分解作用的療效。
　　 在未給予藥物干預(yù)的情況下，正常對照細(xì)胞在PDA示蹤試驗的第4天，熒光信號基本消失，說明第一天PDA標(biāo)記的脂滴已經(jīng)被代謝出細(xì)胞外，而在PNPLA2基因突變患者，在第6天仍有大量的熒光信號殘余，說明脂滴代謝過程明顯慢于正常對照。Formoterol藥物干涉后，正常對照細(xì)胞在PDA示蹤試驗的第2天，熒光信號基本消失，該代謝過程明顯快于未予藥物干涉組，而在PNPLA2基因突

24、變患者，第6天殘余的熒光信號強度明顯弱于未予藥物干涉組，說明Formoterol確實加快了患者體內(nèi)甘油三酯的代謝過程。但是終末點觀察實驗的熒光染色顯示，患者的成纖維細(xì)胞在藥物干預(yù)前后的脂肪特異性熒光染色信號未見明顯的變化;同時TAG試劑盒的定量分析也顯示，在Formoterol處理成纖維細(xì)胞的2個藥物劑量100nM，10μM和苯扎貝特的2個藥物劑量100μM，1mM，于6天的觀察時間段內(nèi)未見明顯降低。但是正常對照Formoterol的1

25、0μM和苯扎貝特的100μM劑量組在藥物處理第二天可見輕度降低趨勢。這說明藥物對脂滴的動態(tài)平衡影響有限，可能僅在一定程度上加快脂滴代謝的速度，而對細(xì)胞內(nèi)累積的脂滴的分解代謝作用緩慢，特別是在患者脂肪代謝酶缺陷的情況下，對脂滴分解的促進作用慢于正常對照，因此在PNPLA2基因突變患者的細(xì)胞，6天的觀察期內(nèi)無法看到顯著的效果。
　　 綜上所述
　　 1、本研究提示中國人LSM的病因主要是ETFDH基因突變導(dǎo)致的核黃素反應(yīng)性M

26、ADD。另外一小部分LSM是由于PNPLA2基因突變導(dǎo)致的單純肌病型中性脂肪貯積癥。ETFDH基因突變以復(fù)合雜合突變?yōu)橹?，突變形式多樣化。中國北方人群有兩個熱點突變c.1227A＞C和c.770A＞G。
　　 2、MADD患者體內(nèi)FAD與突變的ETF:QO蛋白結(jié)合率的降低為其主要發(fā)病機制?；颊逧TF:QO蛋白突變多位于FAD結(jié)合域，因此突變可造成酶蛋白和輔因子FAD的結(jié)合能力下降。而突變蛋白的表達量未見明顯下降。