近交系胎鼠中腦前體細(xì)胞的體外培養(yǎng)以及骨髓基質(zhì)細(xì)胞對(duì)其營(yíng)養(yǎng)作用的初步研究.pdf

1、第一部分近交系大鼠胚胎中腦前體細(xì)胞體外培養(yǎng)研究 目的：體外培養(yǎng)近交系大鼠胚胎腹側(cè)中腦前體細(xì)胞(ventralmesencephalicprecursor,VMP)并誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元(dopaminergicneuron，DN)，為進(jìn)一步研究DN定向分化的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 方法：取材胎齡n天(E11)的近交系大鼠胚胎VMP，體外用含堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basicfibroblastgrowthfactor，b

2、FGF)的無(wú)血清培養(yǎng)液擴(kuò)增培養(yǎng)7天，然后換用含L一抗壞血酸-2-磷酸酯倍半鎂鹽(L-Ascorbicacid-2-phosphatesesquimagnesiumsalt，AA-2P)的特殊培養(yǎng)液誘導(dǎo)分化7天，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并繪制生長(zhǎng)曲線。分別以TH(酪氨酸羥化酶)、β．Tubulin(微管蛋白)、Nestin(巢蛋白)、GFAP(神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白)抗體標(biāo)記DN、神經(jīng)元、前體細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞，鑒定VMP分化情況，流

3、式細(xì)胞儀檢測(cè)分化細(xì)胞中的TH陽(yáng)性細(xì)胞比例。 結(jié)果：近交系大鼠胚胎VMP在體外培養(yǎng)時(shí)能快速擴(kuò)增并分化，培養(yǎng)14天后細(xì)胞總數(shù)擴(kuò)增至培養(yǎng)前49．76±6．34倍，免疫熒光染色顯示β—TubulinIII陽(yáng)性的神經(jīng)元中(71．33±20．42)％為T(mén)H陽(yáng)性的DN，后者占細(xì)胞總數(shù)的(24．85±12．85)％。細(xì)胞體系中還包括一些前體細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞等。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)占神經(jīng)元總數(shù)的75．45％。 結(jié)論：近交系

4、大鼠胚胎VMP在合適的體外培養(yǎng)條件下能夠快速增殖，經(jīng)誘導(dǎo)能定向分化為較高比例的DN，可以作為深入研究DN定向分化分子機(jī)制的細(xì)胞模型。 第二部分骨髓基質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)中腦前體細(xì)胞增殖及分化作用的實(shí)驗(yàn)研究 目的：觀察骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bonemarrowstromalcell，BMSC)對(duì)VMP體外擴(kuò)增和定向分化的影響，并分析其可能機(jī)理。 方法：分別取材E¨大鼠胚胎VMP、成年大鼠BMSC進(jìn)行體外培養(yǎng)，并建立二者的共培養(yǎng)體系。

5、體外擴(kuò)增7天的VMP分別加入普通分化液、BMSC分化液、BMSC+VMP共培養(yǎng)分化液進(jìn)行誘導(dǎo)分化，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，分化期末行免疫熒光染色，統(tǒng)計(jì)三組細(xì)胞中TH陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例并比較分析。 結(jié)果：誘導(dǎo)分化7天后，對(duì)照組、BMSC分化液組和BMSC+VMP共培養(yǎng)分化液組中細(xì)胞數(shù)分別較培養(yǎng)前擴(kuò)增44．13+4．75倍、60．63±5．25倍、64．00±7．63倍。TH陽(yáng)性細(xì)胞比例分別為(18．76±5．20)％、(23．49