不同接種密度培養(yǎng)胎鼠脊髓神經(jīng)前體細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景： 脊髓損傷(SCI)是骨科的多發(fā)病之一，后果嚴(yán)重，預(yù)后差，如何有效治療一直是臨床上的難題。隨著神經(jīng)細(xì)胞體外培養(yǎng)的成功，外源性神經(jīng)細(xì)胞移植治療SCI成為了研究的熱點(diǎn)。供體細(xì)胞的選擇是移植的第一步。近年來，隨著對(duì)譜系限制性神經(jīng)前體細(xì)胞進(jìn)一步的研究，使其成為了供體細(xì)胞的良好選擇。然而，目前對(duì)于譜系限制性神經(jīng)前體細(xì)胞的貼壁培養(yǎng)技術(shù)仍無系統(tǒng)研究。本實(shí)驗(yàn)研究的譜系限制性神經(jīng)前體細(xì)胞來源于胎鼠脊髓神經(jīng)前體細(xì)胞(NPC)，通過比較NPC在

2、不同接種密度下的生物學(xué)特性，旨在為NPC貼壁培養(yǎng)技術(shù)的建立提供參考。 神經(jīng)前體細(xì)胞包括神經(jīng)干細(xì)胞和譜系限制性神經(jīng)前體細(xì)胞，這些細(xì)胞均具有分化成熟的能力。神經(jīng)干細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)中最原始的細(xì)胞，具有高度分化潛能，一直是細(xì)胞移植研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。Cao．Q．L等研究表明，將神經(jīng)干細(xì)胞移植入成鼠的損傷脊髓后，移植的細(xì)胞只能分化成星型膠質(zhì)細(xì)胞，這是因?yàn)閾p傷后的脊髓微環(huán)境不支持神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化。近年來，Han S．S．等研究發(fā)現(xiàn)這種微

3、環(huán)境卻允許神經(jīng)元限制性前體細(xì)胞(NRP)和膠質(zhì)限制性前體細(xì)胞(GRP)的存活及分化，因此譜系限制性的神經(jīng)前體細(xì)胞(NRP/GRP)作為細(xì)胞移植供體成為了新的研究熱點(diǎn)。 神經(jīng)前體細(xì)胞的培養(yǎng)方法有很多種，目前應(yīng)用最多的是懸浮培養(yǎng)法以及貼壁培養(yǎng)法。在懸浮培養(yǎng)方式下，細(xì)胞聚集成為神經(jīng)球，增殖旺盛，培養(yǎng)的細(xì)胞逐漸純化為以神經(jīng)干細(xì)胞為主；在貼壁培養(yǎng)方式下，使NPC黏附于經(jīng)過特殊處理的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板上生長(zhǎng)，其增殖能力相對(duì)較弱，但貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞

4、經(jīng)過逐漸純化后以NRP/GRP為主。所以NPC的貼壁培養(yǎng)近年來受到了越來越多的重視，但不同學(xué)者貼壁培養(yǎng)NPC的密度不盡相同。因此，如何改善NPC的培養(yǎng)方法，使其具有最佳的生物學(xué)活性，需要我們進(jìn)一步的研究。 目的： 1．探討不同密度接種胎鼠脊髓神經(jīng)前體細(xì)胞的存活率，貼壁率，增殖率，以及移植前神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元限制性前體細(xì)胞、膠質(zhì)限制性前體細(xì)胞的比例。 2．觀察貼壁培養(yǎng)的神經(jīng)前體細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后能否分化為成熟的神經(jīng)細(xì)胞。

5、 材料和方法： 取孕13.5天的SD大鼠胚胎脊髓組織，按1.25×104/cm2、2.5×104/cm2.5×104/cm2、10×104/cm2，四個(gè)不同密度接種于層粘連蛋白(20μg/ml)和多聚賴氨酸(13.3 μg/ml)包被的培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板中，培養(yǎng)三天后： 1．分別用MTT法計(jì)算細(xì)胞存活率；用高倍鏡下計(jì)數(shù)計(jì)算貼壁率；用流式細(xì)胞儀行Brdu增殖率、Nestin、PSA-NCAM、A2B5抗體檢測(cè)。

6、 2．培養(yǎng)3天后更換培養(yǎng)液為分化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每3天換液1次，培養(yǎng)一周。 結(jié)果： 1．四個(gè)細(xì)胞密度組由低到高：MTT均值分別為0.2597、0.14535、0.076925、0.0474625；貼壁率均值分別為96.673％、95.40％、94.173％、87.708％；流式細(xì)胞儀檢測(cè)下Brdu標(biāo)記陽性細(xì)胞百分率分別為58.00％、37.45％、52.80％、41.62％；Nestin陽性細(xì)胞百分率分別為4.13％、1

7、.04％、1.97％、2.27％；PSA-NCAM抗體陽性細(xì)胞百分率分別為24.65％、40.75％、10.50％、8.65％；A2B5抗體陽性細(xì)胞百分率分別為41.55％、39.52％、6.61％、12.88％。 2．以2.5×104/cm2接種細(xì)胞后，經(jīng)胎牛血清誘導(dǎo)后可分化成熟，其NF-200，GFAP，Gal-C抗體陽性。 結(jié)論： 細(xì)胞存活率隨接種密度的增高而降低；細(xì)胞貼壁率隨接種密度的增高而降低；細(xì)胞經(jīng)體