Rap1 shRNA的構(gòu)建、體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率鑒定以及對(duì)肝臟再生影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： (1)應(yīng)用RNA干擾技術(shù)合成選擇沉默rap1基因表達(dá)的三種載體。 (2)觀察rap1 shRNA1、rap1 shRNA2、rap1 shRNA3對(duì)小鼠肝臟細(xì)胞中Rap1基因表達(dá)和蛋白表達(dá)的干擾作用。 (3)探討rap1 shRNA對(duì)肝臟細(xì)胞再生的影響作用。 方法： (1)掃描Rap1 mRNA的全序列，記錄三個(gè)AA及下游19個(gè)核苷酸作為潛在作用靶點(diǎn)。GC含量控制在30％～65％之間。由B

2、LAST分析排除與其他基因有高度同源性的序列。由體外轉(zhuǎn)錄合成法合成三種Rap1 siRNA序列：Rap1 siRNA1，Rap1 siRNA2，Rap1 siRNA3和陰性對(duì)照質(zhì)粒。并將其定向克隆到帶有卡那霉素抗性和增強(qiáng)綠色熒光蛋白的真核表達(dá)載體pGenesil-3上。酶切后，進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)。 (2)昆明小鼠40只，體重18～20g，隨機(jī)分成4組：Ⅰ組(轉(zhuǎn)染HK組)、Ⅱ組(轉(zhuǎn)染Rap1 shRNA1組)、Ⅲ組(轉(zhuǎn)染Rap1 shR

3、NA2組)、Ⅳ組(轉(zhuǎn)染Rap1 shRNA3組)。于0、16、24h腹腔內(nèi)注射Rap1 shRNA 2.0～2.5mg/kg(用PBS稀釋至1ml)；48小時(shí)后收集小鼠肝臟，用顯微熒光、定量RT-PCT、免疫組化檢測(cè)小鼠肝細(xì)胞中Rap1 shRNA的轉(zhuǎn)染率，Rap1基因表達(dá)以及蛋白質(zhì)表達(dá)水平。 (3)昆明小鼠20只，體重18～20g，隨機(jī)分成2組：肝大部分切除組(A組，n=10)、肝大部分切除+Rap1 shRNA組(B組，n=

4、10)。A組、B組建立小鼠肝臟大部分切除肝臟再生動(dòng)物模型，B組在關(guān)腹即刻、16、24h腹腔內(nèi)注射Rap1 shRNA2.0～2.5mg/kg(用PBS稀釋至1ml)；A組給予等量PBS； B組、A組，開腹取肝組織，免疫組化法測(cè)定肝臟組織中Rap1、ERK、cycline D1和Ki67蛋白表達(dá)情況，以及RT-PCR測(cè)定肝臟組織中Rap1 mRNA的表達(dá)。 結(jié)果： (1)雙酶切證實(shí)Rap1 siRNA表達(dá)載體克隆構(gòu)建成功，

5、插入片段測(cè)序結(jié)果與合成的siRNA結(jié)果一致。 (2)Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組小鼠肝臟細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)染率均大于50％，Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組的Rap1 mRNA表達(dá)、Rap1蛋白表達(dá)均降低。其中Rap1 shRNA1干擾效果最佳；與轉(zhuǎn)染HK組的細(xì)胞Rap1基因、蛋白表達(dá)比較有顯著差異。 (3)B組肝臟組織細(xì)胞Rap1基因表達(dá)水平明顯高于A組，B組肝組織中Ki67蛋白表達(dá)水平，ERK蛋白表達(dá)水平，cycline D1蛋白表達(dá)水平，Rap