利用體外甲狀腺濾泡模型研究甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控甲狀腺功能中的作用.pdf

1、目的：
　　體外構(gòu)建二腔室甲狀腺濾泡模型，通過(guò)慢病毒載體過(guò)表達(dá)甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子（TTF-1、PAX-8）后檢測(cè)模型二腔室中甲狀腺激素的合成變化，以探討甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控甲狀腺功能中的作用。
　　方法：
　　1.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人甲狀腺上皮細(xì)胞株，將其培養(yǎng)于Transwell培養(yǎng)板（Corning?3450）內(nèi)用于構(gòu)建二腔室模型，待細(xì)胞完全融合隔離了上下腔后，便形成了二腔室模型。以此模型為研究對(duì)象，以培養(yǎng)于6孔板的單層細(xì)胞

2、作為對(duì)照，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加合適濃度碘、1mIU/L TSH，繼續(xù)培養(yǎng)36小時(shí)，采用直接化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)培養(yǎng)液中的FT3、FT4、Tg，采用砷鈰催化分光光度測(cè)定方法檢測(cè)碘濃度。
　　2.根據(jù)GenBank的基因序列設(shè)計(jì)引物，采用PCR克隆TTF-1、PAX-8序列全長(zhǎng)，經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切的片段與pLVX-puro連接后轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐青霉素的LB平板上篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序鑒定。重組慢病毒載體構(gòu)建完成

3、后，應(yīng)用PEI共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞獲得重組慢病毒，獲得的病毒上清經(jīng)滴度測(cè)定后可轉(zhuǎn)染二腔室模型。
　　3.用空載慢病毒轉(zhuǎn)染的二腔室模型作為對(duì)照組，以過(guò)表達(dá)（TTF1、PAX-8）慢病毒轉(zhuǎn)染的二腔室模型作為實(shí)驗(yàn)組，采用直接化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)培養(yǎng)液中的FT3、FT4、Tg，采用砷鈰催化分光光度測(cè)定方法檢測(cè)碘的濃度。
　　結(jié)果：
　　1.二腔室模型FT3、FT4合成及攝碘量比單層細(xì)胞組顯著增加；
　　2.過(guò)表達(dá)TTF-1及PA