SOST-DKK1調(diào)控Wnt通路在氟性骨損傷發(fā)生中作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、隨著現(xiàn)代工業(yè)的迅速發(fā)展,工業(yè)性氟病的危害也越來(lái)越明顯,已成為嚴(yán)重危害暴露人群身心健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題。長(zhǎng)期的氟暴露引起氟在機(jī)體內(nèi)不斷蓄積,氟負(fù)荷超過(guò)機(jī)體代償能力而使骨代謝紊亂,導(dǎo)致以廣泛性骨質(zhì)增生硬化等為主要表現(xiàn)的慢性全身性疾病即氟性骨損傷,但其發(fā)病機(jī)理尚不十分明確。因此,尋找機(jī)體拮抗氟致病因素與機(jī)制以徹底根治和控制氟危害,成為科學(xué)研究防治氟危害的主導(dǎo)方向。
　　氟致成骨活躍和骨轉(zhuǎn)換異常是氟性骨損傷多種病變的共同特征,其損傷與防御的

2、相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控是氟性骨損傷發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。Wnt/?-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是調(diào)控成骨細(xì)胞分化和骨基質(zhì)形成的關(guān)鍵途徑,該通路的活化有利于成骨細(xì)胞的分化,使骨形成增加。Sclerostin(SOST)和Dickkopf1(DKK1)作為Wnt通路的負(fù)調(diào)控因子,在骨形成過(guò)程中起著重要作用。但在高氟負(fù)荷下,SOST與DKK1是如何發(fā)揮調(diào)控作用的,至今尚無(wú)報(bào)道。本研究試圖通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的方法,分析染氟大鼠血清中SOST與DKK1的

3、表達(dá)變化及與氟性骨損傷相關(guān)蛋白因子的關(guān)系,分析不同劑量組、不同時(shí)間點(diǎn)SOST/DKK1/Runx2/ALP蛋白濃度與氟性骨損傷發(fā)生發(fā)展的關(guān)系,初步闡明SOST/DKK1在氟性骨損傷中的作用及其機(jī)制,為氟性骨損傷的防治提供理論依據(jù)。
　　第一部分飲水型SD大鼠氟性骨損傷發(fā)生過(guò)程中相關(guān)指標(biāo)的劑量反應(yīng)關(guān)系研究
　　目的：建立飲水型SD大鼠氟性骨損傷模型,探討氟性骨損傷的發(fā)生及有關(guān)指標(biāo)的劑量反應(yīng)關(guān)系,為研究氟性骨損傷發(fā)病機(jī)制提供科學(xué)

4、準(zhǔn)確的模型基礎(chǔ)。
　　方法：選取SPF級(jí)SD大鼠64只,隨機(jī)分為低劑量組(1.6mg/kgNaF)、中劑量組(16mg/kgNaF)、高劑量組(32mg/kgNaF)和對(duì)照組(0mg/kgNaF);采用飲水加氟的方法建立SD大鼠氟性骨損傷動(dòng)物模型,染氟劑量采用日測(cè)體重然后按體重(mg/kg)給予的方法。模型建立過(guò)程中對(duì)尿氟、血氟進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè),采用微量氟法測(cè)定大鼠尿氟和血氟,采用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行測(cè)定血清堿性磷酸酶(ALP),氟斑

5、牙采用數(shù)碼相機(jī)拍照,根據(jù)氟斑牙數(shù)碼照片并按照氟斑牙觀測(cè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷及分度。對(duì)大鼠右腿股骨及骨周韌帶和膝關(guān)節(jié)囊進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)病理觀察與分析。
　　結(jié)果：大鼠染氟35d時(shí),高劑量組16只大鼠的下切牙均出現(xiàn)氟斑牙,其中93.6％為Ⅱ度氟斑牙,實(shí)驗(yàn)第90d末,高、中劑量組16只SD大鼠的下切牙均出現(xiàn)明顯氟斑牙;染氟7d后尿氟便開(kāi)始升高,其中高、中劑量組尿氟水平分別為(8.48±1.19)mg/L、(6.38±0.53)mg/L與對(duì)照組尿氟

6、(1.09±0.35)mg/L相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.58,P<0.05;t=37.1,P<0.05),染氟35d開(kāi)始,至90d結(jié)束,高劑量組大鼠血氟為(0.251±0.05)mg/L與對(duì)照組血氟水平(0.086±0.08)mg/L相比明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=52.4,P<0.05),高、中劑量組大鼠血清中ALP表達(dá)水平為(216.43±34.43)U/L、(218.02±42.81)U/L、對(duì)照組為(160.55±41

7、.33)U/L,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.635,P<0.05)。染氟劑量與尿氟水平顯著相關(guān)(r=0.924,P=0.038);染氟劑量與血氟水平呈顯著相關(guān)(r=0.948,P=0.026);高、中劑量組大鼠氟負(fù)荷水平明顯高于對(duì)照組;氟斑牙發(fā)生率與染氟劑量呈正相關(guān)(r=0.983,P=0.017)。對(duì)照組和低劑量組大鼠骨膜由單層的成骨細(xì)胞及血管等組成,薄而光滑,骨皮質(zhì)未發(fā)現(xiàn)增厚;高、中劑量組大鼠骨膜、骨皮質(zhì)增厚明顯,部分位置可見(jiàn)骨祖母細(xì)

8、胞數(shù)量增多。
　　結(jié)論：染氟劑量愈高則氟斑牙發(fā)生時(shí)間愈早,染氟劑量與氟斑牙發(fā)生率存在明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系;16mg/kg和32mg/kg的染氟劑量,14d即可發(fā)生Ⅰ度氟斑牙,35d即可發(fā)生典型氟斑牙;染氟進(jìn)行到35和90d時(shí),高、中劑量組大鼠血清中ALP水平較對(duì)照組明顯升高,大鼠骨轉(zhuǎn)換狀態(tài)開(kāi)始加速,成骨功能活躍,骨骼是氟的重要靶器官;經(jīng)90d染氟,高、中劑量組SD大鼠股骨的皮質(zhì)及骨膜增厚,部分骨皮質(zhì)及骨膜內(nèi)可見(jiàn)骨祖母細(xì)胞數(shù)量增多,高

9、氟可導(dǎo)致致骨損傷。
　　第二部分氟性骨損傷中SOST/DKK1對(duì)Wnt/?-catenin信號(hào)通路的調(diào)控作用
　　目的：觀察染氟大鼠血清中SOST、DKK1、Runx2表達(dá)水平的變化,探討SOST/DKK1在經(jīng)典Wnt通路調(diào)控Runx2表達(dá)中的作用,為氟性骨損傷的防治提供理論依據(jù)。
　　方法：選取SPF級(jí)SD大鼠64只,隨機(jī)分為低劑量組(1.6mg/kgNaF)、中劑量組(16mg/kgNaF)、高劑量組(32mg/k

10、gNaF)和對(duì)照組(0mg/kgNaF);采用微電極法測(cè)定尿氟、血氟;全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中堿性磷酸酶(ALP)活力;采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA法)測(cè)定血清中SOST和DKK1水平;同時(shí)采用ELISA方法檢測(cè)Runx2;分析血清SOST/DKK1水平與血氟、ALP及Runx2等氟性骨損傷指標(biāo)的相關(guān)性。采用SPSS18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　結(jié)果：高劑量組在第35d時(shí),SOST血清濃度為(11.55±1.02)μg/

11、L,與對(duì)照組(12.91±0.59)μg/L相比,表達(dá)開(kāi)始下降,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.460,P=0.007);Runx2血清濃度為(120.42±12.40)μg/L,與對(duì)照組(111.21±13.49)μg/L,表達(dá)開(kāi)始升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=11.6,P<0.05);第90d時(shí),高、中劑量組SOST表達(dá)水平為(8.86±0.85)μg/L、(9.37±1.31)μg/L,與對(duì)照組(12.45±1.33)μg/L相比,表

12、達(dá)水平明顯下降,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=34.318,P=0.000);Runx2表達(dá)(116.76±15.66)μg/L、(104.82±16.19)μg/L,與對(duì)照組(89.62±7.15)μg/L相比較,表達(dá)顯著升高,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=15.152,P=0.000);第90d時(shí),大鼠體內(nèi)SOST與Runx2表達(dá)水平呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.444,P=0.000)。第35d時(shí),高劑量組大鼠血清中DKK1表達(dá)水平為(10.5

13、8±1.47)μg/L,與對(duì)照組(10.84±1.03)μg/L相比,表達(dá)水平有下降趨勢(shì)但并未出現(xiàn)明顯降低,差異尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.359,P=0.783);染氟第90d,高劑量組大鼠血清中DKK1表達(dá)水平為(7.22±1.76)μg/L,與對(duì)照組(10.43±1.04)μg/L比較,DKK1表達(dá)明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=23.047,P=0.000)。染氟后大鼠體內(nèi)DKK1表達(dá)水平與Runx2水平也呈負(fù)相關(guān);染氟第35d,大

14、鼠血清中DKK1與Runx2表達(dá)水平的相關(guān)系數(shù)r=-0.018,P=0.887;在染氟第90d,大鼠血清中兩種蛋白的表達(dá)水平呈現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的相關(guān)性(r=-0.370,P=0.002)。
　　結(jié)論：對(duì)SD大鼠進(jìn)行16mg/kg和32mg/kg連續(xù)90d的染氟,可導(dǎo)致成骨抑制因子SOST和DKK1表達(dá)水平降低,成骨必需的因子Runx2和ALP表達(dá)水平升高;氟負(fù)荷越高,SOST和DKK1表達(dá)水平越低,SOST和DKK1表達(dá)水平與染氟劑