WNT信號通路在hMSCs相關(guān)的II型骨質(zhì)疏松癥發(fā)生中的作用.pdf

1、第一部分 入骨髓基質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化鑒定
　　 [目的]利用實驗室已建立的hMSCs的培養(yǎng)方案,建立hMSCs的培養(yǎng)體系并做鑒定,為后續(xù)的實驗研究提供細胞來源。
　　 [方法]骨髓樣本取自美國波士頓市Brigham and Women's Hospital骨科因骨關(guān)節(jié)炎行全髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)病人,從手術(shù)中分離的股骨頭中分離獲得。以密度梯度離心法獲得單個核細胞,以貼壁分離方法獲得hMSCs,在含有10％FBS的α-ME

2、M的培養(yǎng)基中培養(yǎng)和傳代擴增。在成骨、成脂肪、成軟骨誘導(dǎo)下培養(yǎng),分別用ALP活性檢測、Alizarin Red S染色鑒定成骨細胞分化;利用Oil Red-O染色鑒定脂肪分化;利用Alcian blue染色鑒定軟骨細胞分化。
　　 [結(jié)果]原代培養(yǎng)24h部分細胞開始貼壁伸展變形,48-72h后呈紡錘形或梭形,偶見形成集落,培養(yǎng)5-7d后見貼壁生長的細胞增殖迅速,可見多個細胞集落形成,當(dāng)培養(yǎng)至第12-14d時,細胞已大部分融合,長滿

3、培養(yǎng)皿底,細胞成長梭形(成纖維樣外觀),有的細胞呈交叉重疊生長。一般5-10d可傳一代,細胞可連續(xù)傳4-10代。成骨細胞誘導(dǎo)分化后可檢測到ALP活性,并見Alizarin Red S染色陽性細胞形成。成脂誘導(dǎo)分化后可見不同形狀的Oil Red-O陽性染色細胞形成。成軟骨細胞誘導(dǎo)分化可見Alcian blue陽性染色細胞形成。
　　 [結(jié)論]應(yīng)用本實驗方法從骨髓分離、培養(yǎng)和擴增獲得 hMSCs,具有向成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞分

4、化的能力。
　　 第二部分 年齡和性別對人骨髓基質(zhì)干細胞WNT基因表達的影響
　　 [目的]已有的研究對于hMSCs的WNT基因表達的描述不相一致,作者推測年齡和性別和其它臨床因素的差異可以解釋過去的研究顯示的WNT基因在hMSCs中表達的不同。利用不同年齡和性別來源的hMSCs,檢測WNT基因的表達,建立WNT基因在hMSCs的表達譜。
　　 [方法]骨髓樣本取自美國波士頓市Brigham and Women'

5、s Hospital骨科行全髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)的病人,從手術(shù)中分離的股骨頭中分離獲得。共19例樣本來源的hMSCs被列入實驗研究,來源包括12例女性和7例男性,年齡為36-85歲。其中9例為年輕樣本(＜50歲,平均42.0±4.6歲),10例為老年樣本(＞55歲,平均69.3±9.5歲)。12例樣本來源女性為37-85歲,平均58.6±16.0歲,7例樣本來源男性為36-82歲,平均52.6±16.0歲。將hMSCs在100mm組織培養(yǎng)皿中

6、培養(yǎng)用傳代至第2代(P2)和第4代(P4)的細胞進行實驗。由于hMSCs來源于不同的個體,他們進行全髖關(guān)節(jié)置換的手術(shù)時間不同,為保證實驗條件的一致性,所有的實驗均采用標準的條件。hMSCs經(jīng)體外培養(yǎng)、收集存儲于Trizol試劑,冷凍于-80℃。所有19個樣本收集齊全后同時進行RNA分離實驗。最后采用RT-PCR檢測所有WNT基因的表達。
　　 [結(jié)果]WNT2、3、4、5A、5B、6、7B、10B、11、13、14和16B共12

7、個WNT基因被檢測到在hMSCs中表達。相對于年老樣本來源的hMSCs,年輕來源者表達WNT7B和WNT14顯著升高。除此之外,WNT2和WNT13基因表達在年輕樣本來源hMSCs組顯示出表達顯著升高的趨勢。WNT基因表達和年齡相關(guān)性分析顯示:WNT7B、WNT14和WNT13的表達強度與年齡呈顯著反向相關(guān)。進一步分析顯示,相對于女性來源的hMSCs樣本,男性來源的hMSCs中WNT16B表達顯著升高。WNT11在女性來源的hMSCs樣

8、本中表達呈現(xiàn)出顯著性升高的趨勢。在女性樣本來源的hMSCs,WNT13基因表達與年齡呈現(xiàn)顯著反向相關(guān)性。WNT4基因表達與年齡呈現(xiàn)顯著正向相關(guān)性。在男性hMSCs,WNT7B基因表達與年齡呈現(xiàn)顯著反向相關(guān)性,WNT14表達與年齡呈現(xiàn)反向相關(guān)性趨勢。
　　 [結(jié)論]在hMSCs,大部分的老化相關(guān)的WNT基因?qū)儆诮?jīng)典WNT基因,WNT2、7B、13和14是年齡相關(guān)性WNT基因;除此之外,WNT4、7B、13、14和16的表達呈現(xiàn)性別

9、特異性。
　　 第三部分 WNT信號通路對于hMSCs向脂肪細胞、成骨細胞和軟骨細胞分化的影響
　　 [目的]已有的采用小鼠脂肪前體細胞研究脂肪分化機制的結(jié)果表明,Wnt10b可以抑制脂肪分化并且促進成骨細胞分化,Wnt4和Wnt5可以促進脂肪細胞的分化,Wnt3a可以提高bmp2誘導(dǎo)的小鼠C3H10T1/2細胞向軟骨細胞分化的能力。對于WNT信號通路在人脂肪細胞、成骨細胞和軟骨細胞分化過程中的作用知之甚少。本實驗設(shè)想W

10、NT信號通路調(diào)節(jié)hMSCs向脂肪細胞分化、成骨細胞分化和軟骨細胞分化,擬檢測經(jīng)典和非經(jīng)典WNT信號通路在hMSCs向脂肪細胞分化中的作用,并且采用一個小分子的β-catenin激活劑(SB-216763)模擬經(jīng)典WNT信號通路,闡述激活經(jīng)典WNT信號通路對于hMSCs向脂肪細胞、成骨細胞和軟骨細胞分化的影響。
　　 [方法]骨髓樣本取自美國波士頓市Brigham and Women's Hospital骨科因骨關(guān)節(jié)炎行全髖關(guān)節(jié)置

11、換手術(shù)病人,經(jīng)當(dāng)?shù)蒯t(yī)學(xué)倫理委員會IRB允許,從手術(shù)中分離的股骨頭中采用密度梯度離心分離獲得。hMSCs在成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng),采用RT-PCR檢測脂肪分化相關(guān)基因和WNT基因的表達,Western Immunoblotting檢測β-catenin的表達,采用一個小分子的β-catenin激活劑SB-216763模擬經(jīng)典WNT信號通路,檢測激活經(jīng)典WNT信號通路對于hMSCs向脂肪細胞、成骨細胞和軟骨細胞分化的影響。

12、>　　 [結(jié)果]對脂肪細胞的標志基因的檢測結(jié)果顯示,在hMSCs成脂肪誘導(dǎo)1d后,檢測到PPARγ2和LPL的基因表達,并隨著繼續(xù)培養(yǎng)而升高。Adipsin的表達隨著成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)時間的延長亦呈進行性升高。經(jīng)典WNT家族成員,包括WNT2、10B、13、14表達逐漸降低,同時,非經(jīng)典WNT家族成員,包括WNT4和11表達逐漸升高。然而,WNT5A的表達基本保持不變。WNT11是唯一的一個在脂肪分化標志基因出現(xiàn)表達升高之前表達改變的WNT

13、基因。SB-216763(5μM)可以升高β-catenin在hMSCs中的表達水平,并且通過阻斷PPARγ2、LPL和adipsin的基因表達抑制脂肪分化。與分子水平的作用一致,SB-216763模擬的經(jīng)典WNT信號通路抑制脂肪細胞分化呈現(xiàn)時間和劑量依賴性。激活經(jīng)典WNT信號通路可以抑制成骨細胞標志基因ALP的表達,抑制ALP的活性,促進軟骨細胞標志基因RUNX2和COLⅡ的表達,促進Ⅱ型膠原的分泌。
　　 [結(jié)論]在hMSC

14、s向脂肪細胞分化的過程中,非經(jīng)典WNT信號通路的WNT4和11而非WNT5A可能是主要促進因子,而激活經(jīng)典WNT信號通路可以阻止hMSCs向脂肪細胞、成骨細胞分化,促進其向軟骨細胞分化。本實驗研究說明在不同物種間,Wnt信號通路在向脂肪細胞和成骨細胞分化中所起的作用存在不同。
　　 第四部分 老化和性別對于hMSCs向脂肪細胞分化的影響
　　 [目的]本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增加hMSCs發(fā)生一系列變化,向成骨細

15、胞分化能力降低。本實驗采用不同年齡和性別個體來源的hMSCs進行體外成脂誘導(dǎo)培養(yǎng),觀察其年齡和性別對hMSCs成脂肪細胞分化的影響,以期待揭示Ⅱ型骨質(zhì)疏松患者骨髓腔脂肪容量增多的機制。
　　 [方法]15例hMSCs被列入實驗研究,來源包括8例女性和7例男性,年齡為17-90歲,包括5例年輕樣本和10例年老樣本。在成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)18d后檢測不同年齡和性別組hMSCs形成脂肪細胞的差異。對于hMSCs脂肪細胞及成骨細胞相關(guān)基因表達相

16、關(guān)實驗研究,共有19例不同樣本來源的hMSCs被納入實驗,包括12例女性和7例男性,年齡為36-85歲。其中9例為年輕樣本,10例為老年樣本,在基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下,檢測脂肪細胞和成骨細胞標志基因在不同年齡和性別組之間表達的差異。
　　 [結(jié)果]年老來源的hMSCs在成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下,形成的脂肪細胞數(shù)目是年輕來源的hMSCs的2.35倍,但是統(tǒng)計學(xué)無顯著性差異(P=0.30)。不同樣本來源的hMSCs形成脂肪細胞數(shù)目和年齡的相關(guān)性分

17、析顯示,體外成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下,hMSCs分化成脂肪細胞的能力和年齡無顯著相關(guān)性(Spearman,r=0.01899,P=0.95)。脂肪細胞的標志基因PPARγ2、LPL、Adipsin在年老來源的hMSCs中表達高于年輕來源的hMSCs,但是統(tǒng)計學(xué)均無顯著性差異。成骨細胞標志基因RUNX2在年老來源的hMSCs中表達高于年輕來源者,而OC、ALP的表達在年老來源的hMSCs中高于年輕來源者,三者均無統(tǒng)計學(xué)差異。基因表達和年齡相關(guān)性