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文檔簡介
1、Daintain(大炎肽)是1994年由Chen等從豬的小腸中分離純化出的一種新的生物活性蛋白,其氨基酸序列與1995年由Utans等人在大鼠心臟移植排斥反應(yīng)中克隆出的巨噬細(xì)胞因子Allograft Inflammatory Factor-1(同種異體移植炎癥因子-1,AIF-1)高度同源(90%),兩者屬不同物種來源的同一蛋白質(zhì),故并稱為Daintain/AIF-1。Daintain/AIF-1分子量17kD,主要由激活的巨噬細(xì)胞表達(dá)
2、和分泌,是一種多功能的細(xì)胞因子,廣泛參與炎癥和免疫相關(guān)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程,如血管病變、移植排斥、腫瘤以及自身免疫疾病等。
1型糖尿病(Type1 Diabetes Mellitum,T1DM)是一種T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病,以胰島炎引發(fā)的胰島β細(xì)胞的選擇性破壞為特征。在發(fā)病前的胰島炎階段,活化的巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等大量浸潤胰島,釋放出炎癥介質(zhì)如細(xì)胞因子和NO等協(xié)同作用,引起β細(xì)胞凋亡、壞死以及胰島素分泌異常等功能損
3、傷,進(jìn)而發(fā)展為T1DM。目前T1DM發(fā)病的分子機理還未完全闡明,但大量研究表明炎癥和免疫相關(guān)的細(xì)胞因子在這一進(jìn)程中起著關(guān)鍵作用。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)Daintain/AIF-1在正常胰腺組織中不表達(dá),但在T1DM模型BB大鼠侵潤胰腺的巨噬細(xì)胞中大量表達(dá),表明炎癥因子Daintain/AIF-1與T1DM的發(fā)病機理有關(guān),但具體機制仍未明確。為了研究Daintain/AIF-1在T1DM發(fā)病中的作用,本論文主要開展了以下工作:
第一
4、部分:以大鼠β細(xì)胞系INS-1為實驗?zāi)P停诩?xì)胞水平上研究了Daintain/AIF-1對T1DM中β細(xì)胞功能異常的影響。在細(xì)胞培養(yǎng)基中添加不同濃度的Daintain/AIF-1刺激后,檢測INS-1細(xì)胞活力、凋亡、周期、胰島素分泌和NO產(chǎn)量的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn):
1. Daintain/AIF-1對INS-1細(xì)胞具有毒性作用,能抑制細(xì)胞活力。
2. Daintain/AIF-1能夠誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞的凋亡,特別是早期凋
5、亡。提示Daintain/AIF-1可能在凋亡的起始階段起刺激性作用,最終導(dǎo)致INS-1細(xì)胞活力的降低。
3. Daintain/AIF-1不影響INS-1細(xì)胞的基礎(chǔ)胰島素分泌,但是抑制了20mM葡萄糖條件下的葡萄糖刺激的胰島素分泌(GSIS)水平,說明Daintain/AIF-1損傷了INS-1細(xì)胞的葡萄糖反應(yīng)性,這是Daintain/AIF-1對INS-1細(xì)胞毒性作用的另一個方面。
4. Daintain/AIF
6、-1顯著提升了INS-1細(xì)胞的NO產(chǎn)量,推測NO水平的上升可能和細(xì)胞凋亡的增加和GSIS的下降有關(guān),可能是Daintain/AIF-1誘導(dǎo)的β細(xì)胞毒性作用的機制之一。
5. Daintain/AIF-1影響INS-1細(xì)胞周期,將細(xì)胞阻滯在G0/G1期,使得進(jìn)入S期和G2/M期的細(xì)胞減少,以此來抑制細(xì)胞增殖,且Daintain/AIF-1濃度越大,作用越明顯。
第二部分:尋找Daintain/AIF-1在胰腺中的相互作
7、用蛋白,為深入了解Daintain/AIF-1對β細(xì)胞毒性作用機制提供思路。采用Clontech MatchmakerTM GAL4酵母雙雜交系統(tǒng)3來進(jìn)行人胰腺MatchmakerTM cDNA文庫中Daintain/AIF-1相互作用蛋白基因的篩選,主要結(jié)果為:
1.構(gòu)建了誘餌質(zhì)粒pGBKT7-Daintain/AIF-1,經(jīng)檢測可以在AH109酵母中正
確表達(dá)出誘餌融合蛋白BD-Daintain/AIF-1,對酵
8、母細(xì)胞無毒性,且沒有自激活性。
2.擴增了人胰腺cDNA文庫,轉(zhuǎn)化入AH109/pGBKT7-Daintain/AIF-1酵母,涂布SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板并進(jìn)行β-半乳糖苷酶活性檢測,初步篩選出64個Ade+His+lacZ+三陽性候選酵母克隆。
3.進(jìn)行回轉(zhuǎn)實驗和一對一驗證實驗排除假陽性,結(jié)果僅獲得1種文庫質(zhì)粒。對其cDNA插入片段測序后Blast比對并進(jìn)行閱讀框分析,發(fā)現(xiàn)該片段翻譯時發(fā)生
9、了移碼,僅表達(dá)出一段32個氨基酸殘基的未知小肽段,說明該質(zhì)粒是假陽性。本次篩選未獲得陽性結(jié)果,是酵母雙雜交系統(tǒng)假陽性率非常高這一重大缺陷的一次實例。
綜上,本研究首次發(fā)現(xiàn)Daintain/AIF-1對INS-1細(xì)胞具有毒性作用,Daintain/AIF-1可能通過將細(xì)胞阻滯在G0/G1期來抑制細(xì)胞增殖,以及上調(diào)NO產(chǎn)量來刺激細(xì)胞凋亡和損傷胰島素分泌。這說明細(xì)胞因子Daintain/AIF-1促進(jìn)了β細(xì)胞的功能異常,在T1DM的
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