梭子蟹乳化病的病原及診斷技術的研究.pdf

1、梭子蟹(Portunus trituberculatus)隸屬于甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)、梭子蟹屬（Portunus），是浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖主要品種之一。為了進一步搞清養(yǎng)殖梭子蟹乳化病的病原及其致病機理，找到有效的防治方法，本文以典型癥狀的病蟹作為材料，通過菌株的分離鑒定、人工感染試驗、病理組織觀察等手段，對梭子蟹乳化病的病原進行了研究，并且采用血液生理生化指標、ELIS

2、A 、免疫熒光和UPPCR-SSCP等技術對梭子蟹乳化病進行診斷，以期為梭子蟹乳化病的早期診斷及防治提供科學依據(jù)。 2002～2004年在浙江省寧波、舟山等地養(yǎng)殖場，從瀕死的梭子蟹體內(nèi)分離到兩株菌分別為1205－11和1205－21。通過菌體形態(tài)、培養(yǎng)特性和生理生化反應，鑒定這兩株菌分別為溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）和葡萄牙假絲酵母(Candida lusitaniae)。人工感染證實：這兩株菌是梭子蟹乳

3、化病的病原菌，溶藻弧菌是主要病原菌，葡萄牙假絲酵母為繼發(fā)性感染，蟹體的損傷部位是傳播的主要途徑。 對患乳化病的梭子蟹進行了血液生化指標檢測。結果表明，與健康梭子蟹相比：肌酐、總膽固醇、鈉、氯、鎂和鈣等指標明顯上升，而血糖、總蛋白、白蛋白、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶等指標卻顯著下降。通過人工感染試驗的追蹤檢測，并與對照組相比，感染后24h發(fā)生明顯變化的血液生化指標為血糖、總膽固醇、總蛋白、谷草轉氨酶和鎂，此五種

4、指標可作為梭子蟹乳化病的早期診斷指標。 以梭子蟹乳化病的病原菌――溶藻弧菌為抗原，制成免疫血清，利用辣根過氧化酶標記的羊抗兔血清（HRP-IgG）為酶標二抗，建立了檢測溶藻弧菌的間接ELISA快速診斷法。結果表明，應用間接ELISA技術檢測溶藻弧菌有較高的靈敏度，最低的檢測量為1×104cfu/mL。同時交叉反應表明其具有較高的特異性。人工感染48h后，就能在血淋巴和鰓中檢測到溶藻弧菌。應用建立的間接ELISA法進行現(xiàn)場檢測，表

5、觀有病蟹的陽性檢出率為90﹪，表觀健康蟹的陽性檢出率為20﹪，養(yǎng)殖海水中沒有陽性檢出。 以梭子蟹乳化病的病原菌――溶藻弧菌為抗原，制血兔抗血清，利用異硫氰酸熒光素標記的羊抗兔血清建立了梭子蟹乳化病的間接熒光抗體快速診斷法。結果表明，應用間接熒光抗體技術檢測溶藻弧菌有較高的靈敏度，最低的檢測量為1×105cfu/mL。同時交叉反應表明其具有較高的特異性。人工感染試驗24h后，就能在鰓和血淋巴中檢測到溶藻弧菌。應用建立的間接熒光抗體

6、技術進行現(xiàn)場檢測，表觀有病蟹的陽性檢出率為90﹪以上，表觀健康蟹的陽性率檢出率為20﹪，養(yǎng)殖海水中沒有陽性檢出，與ELISA檢測結果大致相同。 采用通用引物PCR配合SSCP分析即UPPCR-SSCP技術，研究快速檢測梭子蟹乳化病病原菌的分子生物學診斷技術。結果發(fā)現(xiàn)，采用通用引物，溶藻弧菌可以和嗜水氣單胞菌、銅綠假單胞菌、創(chuàng)傷弧菌、河流弧菌等部分常見水產(chǎn)病原菌區(qū)分開來，這樣可以建立一種針對于梭子蟹乳化病致病菌的UPPCR-PCR