13757.共表達(dá)鹽生隱桿藻甘氨酸甲基化酶基因apgsmt和apdmt提高水稻抗逆性研究

1、共表達(dá)鹽生隱桿藻甘氨酸甲基化酶基因卻GS腳和ApDMT提高水稻抗逆性研究重慶大學(xué)碩士學(xué)位論文(學(xué)術(shù)學(xué)位)學(xué)生姓名：熊方杰指導(dǎo)教師：劉永勝教授專業(yè)：生物學(xué)學(xué)科門類：理學(xué)重慶大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院二0一三年四月重慶大學(xué)碩士學(xué)位論文中文摘要摘要甘氨酸甜菜堿(Glycinebetaine，GB)，簡(jiǎn)稱甜菜堿，是一種重要的相容性物質(zhì)，作為滲透調(diào)節(jié)保護(hù)劑廣泛存在于微生物、動(dòng)物和植物中。在植物應(yīng)對(duì)非生物脅迫(如高鹽，低溫、干旱等)過(guò)程中，起到重要的保護(hù)作用

2、，作為滲透調(diào)節(jié)劑，它能夠維持細(xì)胞的滲透平衡；同時(shí)作為滲透保護(hù)劑穩(wěn)定各種酶和蛋白復(fù)合物的四級(jí)結(jié)構(gòu)以及降低膜脂的過(guò)氧化等。甜菜堿的合成途徑，根據(jù)合成的起始底物的不同，大致分為膽堿氧化／還原途徑和甘氨酸甲基化途徑。不同于膽堿氧化／還原途徑，甘氨酸甲基化途徑是以甘氨酸為起始底物，通過(guò)兩個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶(甘氨酸肌氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶和肌氨酸二甲基甘氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶)，逐步的甲基化甘氨酸生成甜菜堿。水稻是一種重要的糧食作物，但它不能合成和積累甜菜堿來(lái)應(yīng)對(duì)非生物

3、脅迫，屬于甜菜堿的非自然積累者。在本研究中，我們通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將來(lái)自嗜鹽微生物鹽生隱桿藻編碼甲基轉(zhuǎn)移酶的兩個(gè)基因(ApGSMT和ApDMT)，共同轉(zhuǎn)入水稻中。獲得了這兩個(gè)基因共表達(dá)的水稻轉(zhuǎn)基因植株，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的表達(dá)、產(chǎn)物合成情況和抗非生物脅迫能力分析得到以下結(jié)果：①通過(guò)半定量PCR(semiRTPCR)和定量PCR(quantitativerealtimePCR，qPCR)分析了ApGSMT和ApDMT在不同植株葉片及

4、不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示在所分析的6個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻植株葉片中，這兩基因都能夠得到表達(dá)，雖然在表達(dá)水平上有所差異。組織表達(dá)模式分析顯示，ApGSMT和ApDMT在水稻的組織(根、莖、葉、葉鞘和花)中也都有表達(dá)。相對(duì)于表達(dá)水平，甜菜堿作為這兩個(gè)酶的終產(chǎn)物，HPLC測(cè)定結(jié)果顯示，在所測(cè)定的成熟葉片和不同組織中，甜菜堿都有合成和積累。在作為對(duì)照的野生型中，ApGSMT和ApDMT的表達(dá)，及終產(chǎn)物甜菜堿都沒(méi)有被檢測(cè)到。②通過(guò)葉片在鹽脅迫條件下

5、的衰老實(shí)驗(yàn)，我們觀察到甜菜堿的積累能夠降低葉片葉綠素的破壞程度，從而保護(hù)水稻葉綠體的完整性。鹽脅迫條件下的萌發(fā)實(shí)驗(yàn)顯示，甜菜堿的積累能夠提高種子的萌發(fā)率，減輕鹽脅迫對(duì)幼苗的生長(zhǎng)抑制；且甜菜堿的積累水平隨脅迫強(qiáng)度的增加而增加。通過(guò)種子在鹽溶液中萌發(fā)后幼苗解除脅迫恢復(fù)生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)基因幼苗在苗高、根長(zhǎng)和生物量有明顯的恢復(fù)的生長(zhǎng)，證明了甜菜堿的積累能夠減輕鹽脅迫對(duì)幼苗的生長(zhǎng)抑制，提高自身的存活和生長(zhǎng)。③低溫環(huán)境脅迫實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這兩個(gè)酶基因的表達(dá)對(duì)