豌豆肌動蛋白異型體（PEAc1）的原核表達(dá)及其藻熒光探針的研制.pdf

1、肌動蛋白在真核生物中廣泛存在,由肌動蛋白參與形成的動態(tài)微絲骨架系統(tǒng)是細(xì)胞生命活動的基礎(chǔ).在植物細(xì)胞中,肌動蛋白由多基因家族編碼,從而產(chǎn)生了多種肌動蛋白異型體.肌動蛋白異型體在植物體內(nèi)的表達(dá)具有組織特異性,在植物生長發(fā)育的不同階段具有不同的表達(dá)模式,從而發(fā)揮不同的功能,它們與眾多肌動蛋白結(jié)合蛋白也具有不同的相互作用.因此,體外研究植物肌動蛋白異型體理化特性將對深入了解它們在體內(nèi)的功能及其動態(tài)調(diào)節(jié)具有重要意義.熒光標(biāo)記技術(shù)雖然廣泛用于細(xì)胞內(nèi)

2、微絲骨架分布及其動態(tài)的研究,但傳統(tǒng)的熒光標(biāo)記方法用于植物肌動蛋白研究時都具有一定的局限性,利用GFP融合以及研制新型的藻熒光探針有助于對植物肌動蛋白的深入了解.利用基因融合技術(shù),原核表達(dá)并從包涵體中純化了豌豆肌動蛋白異型體PEAc1、His-taggedPEAc1、His-tagged GFP以及His-tagged PEAc1-GFP,并通過誘導(dǎo)條件的篩選達(dá)到了可溶性表達(dá)與大量純化His-tagged PEAc1-GFP的目的.利用圓

3、二色譜法對肌動蛋白二級結(jié)構(gòu)的測定表明:與預(yù)測值相比,可溶性表達(dá)與純化的His-tagged PEAc1-GFP具有更為合理的二級結(jié)構(gòu),His-GFP-tag的融合促進(jìn)了PEAc1的可溶性表達(dá)與正確折疊.這一方法可能是解決植物肌動蛋白及其他在包涵體中表達(dá)蛋白難以正確折疊和大量純化的有效途徑之一.對純化的上述肌動蛋白的聚合活性進(jìn)行了詳細(xì)研究.熒光標(biāo)記結(jié)合熒光顯微觀察表明:從可溶性上清中純化的His-tagged PEAc1-GFP聚合形成的

4、微絲不僅可以直接在熒光顯微鏡下觀察,也可被微絲的特異標(biāo)記物鬼筆環(huán)肽所標(biāo)記,而且其直徑、長度以及形態(tài)上與已知的聚合肌動蛋白熒光絲一致;電鏡負(fù)染的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)其直徑為9nm,與傳統(tǒng)微絲直徑相當(dāng)(7-10nm);聚合曲線有明顯的停滯期,為典型的S型聚合曲線,聚合臨界濃度為0.75μmol/L,這一結(jié)果與已有報(bào)道相似.上述結(jié)果表明,通過GFP的融合而在大腸桿菌中可溶性表達(dá)的PEAc1,不僅很好保持了肌動蛋白的聚合活性,而且GFP的熒光特性也方

5、便了微絲體外特性的研究.通過肌動蛋白體外對DNase I以及肌球蛋白ATPase活性影響的研究,發(fā)現(xiàn)單體His-taggePEAc1-GFP能顯著抑制DNase I活性,在肌動蛋白聚合條件下能有效激活肌球蛋白ATPase活性,這一結(jié)果預(yù)示著PEAc1在體內(nèi)可能參與相關(guān)的生命活動,為利用GFP直接與肌動蛋白異型體融合來研究體內(nèi)微絲的動態(tài)變化及其調(diào)節(jié)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù).以原核表達(dá)的PEAc1為抗原制備了免疫活性較好的抗豌豆肌動蛋白的多克隆抗體,

6、從螺旋藻中純化了高純度、高活性、能結(jié)晶的藻膽蛋白,將兩者偶聯(lián)制備的藻熒光探針,不僅保持了藻膽蛋白很強(qiáng)的抗熒光淬滅能力,而且用于豌豆卷須氣孔細(xì)胞熒光標(biāo)記時有更低的熒光背景.對豌豆肌動蛋白藻熒光探針的初步研究,不僅為豌豆肌動蛋白的免疫熒光檢測提供了便利條件,而且通過改變抗體,則可以將藻熒光探針用于其他植物蛋白的標(biāo)記,藻熒光探針優(yōu)越的熒光特性使其在植物材料的免疫熒光檢測中具有廣闊的應(yīng)用前景.對藻藍(lán)蛋白兩個亞基基因的克隆、原核表達(dá)與純化及其熒光