30127.人細胞色素p450氧化還原酶基因多態(tài)性對抗癌藥物及環(huán)境毒物活化的影響研究

1、浙江大學藥學院博士學位論文人細胞色素P450氧化還原酶基因多態(tài)性對抗癌藥物及環(huán)境毒物活化的影響研究姓名：李丹曦申請學位級別：博士專業(yè)：藥物分析學指導教師：洪鈞言陳樞青20090901浙江人學博：學位論文中文摘要涉及。本課題系統(tǒng)地考察了已報道ff可POR錯義突變體在POR參與的抗癌藥物及環(huán)境毒物代謝活化中的影響。首先，利用FlpInTMCHO細胞系統(tǒng)重組表達了PoR野生型及28個錯義突變體，考察了POR錯義突變體對代謝直接底物絲裂霉素C產(chǎn)

2、生細胞毒性的影響；繼而進一步建立了能同時表達CYP酶系和POR的雙表達細胞系，以考察POR的突變體對CYP286介導的環(huán)磷酰胺代謝活化及CYP2A13介導的黃曲霉毒素代謝活化的影響。具體三部分的實驗如下所述：1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染POR突變體的細胞系構(gòu)建及其對絲裂霉素c的敏感性研究該部分實驗應用FlpIn刑CHO系統(tǒng)成功地構(gòu)建了含POR的28種錯義突變體cDNA的表達載體，并完成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染得到經(jīng)Westernblot鑒定能穩(wěn)定表達POR野生型及各突變

3、體的FlpInTMCHO細胞系。之后以該細胞系完成了POR突變體對絲裂霉素C這一重要抗癌前體藥物經(jīng)POR代謝活化引起的細胞毒性的影響的研究。實驗結(jié)果顯示，表達突變體R316W，H628P和V6311的細胞對絲裂霉素C的耐受性顯著提高。而對于突變體Y459H和L565P，表達它們的細胞其對絲裂霉素C的敏感程度幾乎和表達空載體的空白細胞一致。本實驗中得到的該細胞系還可進一步應用于研究POR介導的其他化合物的代謝活化。2利用雙表達系統(tǒng)考察PO

4、R突變體對于CYP286介導的環(huán)磷酰胺細胞毒性的影響該部分實驗中使用了FlpIIl刑cHo細胞系統(tǒng)先隨機穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達了人CYP286，而后利用通過活性篩選確定ff寸CYP286表達量較高的單克隆細胞進行二次轉(zhuǎn)染，使得POR野生型及突變體cDNA定點穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后插入細胞基因組的FlpIn刑位點，從而保證了CYP286和POR野生型及各突變體在不同的轉(zhuǎn)染細胞系中的表達量的一致性。再進一步比較選定POR各突變體對CYP介導的環(huán)磷酰胺代謝的影響。