30369.人gdnf在牛胎兒成纖維細(xì)胞βcasein基因座的定位整合及基因打靶克隆囊胚的制備

1、內(nèi)蒙古大學(xué)博士學(xué)位論文人gdnf在牛胎兒成纖維細(xì)胞βcasein基因座的定位整合及基因打靶克隆囊胚的制備姓名：張學(xué)明申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：動物學(xué)指導(dǎo)教師：吳應(yīng)積20090330摘要包括啟動子、外顯子1、內(nèi)含子1和部分外顯子2的22kb調(diào)控序列和下游57kb序列為57和3’同源臂；neo抗性基因為正篩選因子，位于兩同源臂之間；HSVtk基因和DsRed2基因為雙負(fù)篩選因子，分別位于57和3’同源臂外側(cè)；人砌_f基因置于5’同源臂下游，S

2、V40polyA序列插入到人gdnf軀]下游作為人砌廛因轉(zhuǎn)錄終止信號。經(jīng)PCR檢測、限制性內(nèi)切酶圖譜及DNA測序分析結(jié)果表明，所構(gòu)建載體結(jié)構(gòu)正確。2打靶載體pNRTCNbG的生物學(xué)功能分析為了檢測打靶載體pNRTCNbG的生物學(xué)功能，用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將其導(dǎo)入人乳腺腫瘤上皮細(xì)胞系Bcap37細(xì)胞中，經(jīng)G418抗性篩選810天后，獲得了表達(dá)紅色熒光蛋白的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pNRTCNbG的人乳腺上皮細(xì)胞單克隆。將單克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，經(jīng)PCR檢測結(jié)果表

3、明，生f=flcasein基因啟動子驅(qū)動的)＼gdnf基因已整合到表達(dá)紅色熒光蛋白的人乳腺上皮細(xì)胞中。用催乳素、胰島素及氫化可的松誘導(dǎo)培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，經(jīng)RTPCR和WesternBlot檢測表明，牛flcasein基因啟動子驅(qū)動的^礎(chǔ)陛因能夠在人乳腺上皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄翻譯并分泌到胞外。這些結(jié)果表明，我們構(gòu)建的人薊夥基因在牛flcasein基因座定位整合載體pNRTCNbG具有生物學(xué)功能，同時也表明人乳腺腫瘤上皮細(xì)胞系Bcap37能夠用于乳腺