黑熊成纖維細(xì)胞的冷凍保存及對黑熊-牛克隆胚體外發(fā)育的影響.pdf

1、本文研究了黑熊耳部成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法，并對黑熊成纖維細(xì)胞冷凍保存的冷凍保護(hù)劑和冷凍方法進(jìn)行了篩選，探討了處理后成纖維細(xì)胞對黑熊-牛克隆胚體外發(fā)育的成活影響，為建立黑熊-牛的克隆胚發(fā)育體系，促進(jìn)黑熊-牛后代發(fā)育率，可為制作克隆動(dòng)物、異構(gòu)胚動(dòng)物提供技術(shù)，為實(shí)驗(yàn)室的大局發(fā)展，學(xué)弟學(xué)妹的研究提供理論依據(jù)。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴為了獲得黑熊成纖維細(xì)胞系，將黑熊耳邊緣皮膚組織塊進(jìn)行冷凍，并與未冷凍組織塊比較。結(jié)果為：未冷凍組織塊培

2、養(yǎng)5d后開始游離細(xì)胞，細(xì)胞成活率為75％；冷凍組織塊復(fù)蘇后培養(yǎng)6d開始有細(xì)胞游離，細(xì)胞活率為68.7%。⑵選用不同 density的三種冷凍保護(hù)劑:二甲基亞砜(DMSO：5、7.5、10、12.5%)、乙二醇（EG：10、15、20、25%)、甘油（GC：5、10、15、20%))對黑熊成纖維細(xì)胞進(jìn)行冷凍，結(jié)果為DMSO濃度為7.5%對黑熊耳部成纖維細(xì)胞冷凍效果最好。⑶黑熊成纖維細(xì)胞分別在-70℃和-196℃下凍存一周、一個(gè)月、三個(gè)月，

3、復(fù)蘇后檢驗(yàn)細(xì)胞活率發(fā)現(xiàn)-70℃一周活率較高，-196℃一周、一個(gè)月、三個(gè)月活率無差異。⑷用MTT檢測未冷凍和冷凍復(fù)蘇后3-6、7-9、10-12代組細(xì)胞活力，結(jié)果為,未冷凍與冷凍復(fù)蘇后3-6代組無差異、7-9代、10-12代組差異顯著。⑸使用正常培養(yǎng)的黑熊耳皮膚成纖維細(xì)胞的3-6、7-9、10-12代組分別進(jìn)行供核，結(jié)果為7-9代黑熊成纖維細(xì)胞為最佳供體細(xì)胞代數(shù)，且異種重構(gòu)胚發(fā)育率最好。⑹分別將黑熊耳皮膚成纖維細(xì)胞的3-6、7-9、10