抗菌脂肽固態(tài)發(fā)酵參數優(yōu)化及在對蝦養(yǎng)殖源頭食品安全控制中的應用.pdf

1、抗菌脂肽是由枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、淀粉液化芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)以及納豆菌(Bacillus natto)等為代表的芽孢桿菌產生的一系列脂肽類物質(通常有 surfactin、iturin、fengycin subtilin和sublancin等),其分子通常以環(huán)脂肽的結構存在?？咕木哂锌咕蜕锉砻婊钚詣┨匦?在農業(yè)和醫(yī)藥、化妝品及食品、石油開采和環(huán)境治理等領

2、域有重要的開發(fā)和應用前景,已引起廣泛的關注。
　　液態(tài)發(fā)酵是抗菌脂肽目前發(fā)酵生產廣泛采用的方式,但液態(tài)發(fā)酵存在諸多缺點,如發(fā)酵對設備的高要求,高成本,低產率,且提取純化發(fā)酵液中的產物較難;與液態(tài)發(fā)酵相比固態(tài)發(fā)酵有很多優(yōu)勢,如發(fā)酵基質主要是工農業(yè)生產的的副產物或廢棄物,可以降低生產成本;此外,降低了發(fā)酵設備要求,發(fā)酵效率和成本都大大降低;而且在生產中還可以避免出現液體發(fā)酵過程中難以解決的泡沫問題,且提取工藝大大簡化,成本低廉。然而,

3、關于抗菌脂肽固態(tài)發(fā)酵條件控制的研究鮮有報道,而固態(tài)發(fā)酵條件極大地影響抗菌脂肽的產量,因此研究固態(tài)發(fā)酵抗菌脂肽的工藝條件至關重要。此外,目前對抗菌脂肽固態(tài)發(fā)酵中的許多關鍵技術問題和參數還不清楚,更缺乏系統性地描述整個發(fā)酵過程中各個參數值的變化,從而影響了抗菌脂肽的整體發(fā)酵效率和發(fā)酵的工業(yè)化控制,最終將影響抗菌脂肽高效生產。因而,本研究對抗菌脂肽固體發(fā)酵發(fā)酵動力學進行研究,為系統性地描述整個發(fā)酵過程中各個參數值的變化,達到對工業(yè)化生產高效控

4、制提供支撐。
　　近些年來,隨著凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)養(yǎng)殖的快發(fā)展,導致對蝦養(yǎng)殖體系中水環(huán)境的持續(xù)惡化,致使對蝦的發(fā)病率不斷增加,目前水產病害防治的最主要措施之一是飼料中大量添加抗生素?？股氐拇罅渴褂脮е缕湓趯ξr體中的殘留量大大增加,不但降低了對蝦的抗病能力,形成惡性循環(huán),最后經直接威脅對蝦產品的安全,對人體的健康也將造成巨大危害。同時對蝦原料的帶菌率嚴重,對食品的后續(xù)加工安全性造成威脅。因而,

5、源頭食品的安全性成為迫切解決的問題。因此,尋求綠色、環(huán)保、高效的添加劑來替代抗生素成為提高對蝦抗病能力和改善對蝦產品使用安全性研究的熱點。在諸多的抗生素替代物中,作為一種新型的具有抗菌、免疫調節(jié)、促生長、無殘留、無抗藥性等特點的添加劑,抗菌肽在家禽、家畜和水產養(yǎng)殖方面均有一定的應用。然而,由于抗菌肽的成本高、來源有限,通過基因工程獲得的抗菌肽活性不高等問題,因而找出更為合適的抗生素替代物尤為重要。納豆菌NT-6菌株是本課題組近期分離出的

6、抗菌脂肽高產菌株,通過固體發(fā)酵抗菌脂肽產量達到10 g/(kg·發(fā)酵基質)且具有耐熱性強、pH適應范圍廣、抗菌譜廣、溶解性好和安全無毒等特性,因此將抗菌脂肽作為抗生素的替代品添加到飼料中對提高對蝦抗病能力和食用安全性的研究將有廣泛的應用前景。本論文的研究內容和結果如下:
　　1.網袋固態(tài)發(fā)酵抗菌脂肽參數的優(yōu)化
　　通過單因素試驗確定的最佳發(fā)酵條件為甘蔗渣含量15％、料水比5:5、溫度30℃、發(fā)酵時間48h和20目(Φ10cm

7、×40cm)。在此基礎上,初步確定料水比、溫度、接種量為3個主要影響因素。然后借助軟件 Design Expert8進行響應面實驗設計,找出了影響網袋發(fā)酵抗菌脂肽產量的各主要影響因數的最佳水平和它們之間的交互情況,并建立了預測模型方程。響應面實驗結果表明,抗菌脂肽預測值的最大產量8.74 g/kg時對應的三個主要因素取值分別為:水料比1.18、溫度29.78℃、接種量5.17%。為了測試該模型的精確性,驗證實驗在最優(yōu)條件下進行,抗菌脂肽

8、的產量為8.77 g/kg,和預測值非常接近。
　　2.薄層固態(tài)發(fā)酵抗菌脂肽參數的優(yōu)化
　　以相對濕度、通氣量、厚度為3個主要影響因素,借助軟件 Design Expert8進行響應面實驗設計,找出了影響薄層發(fā)酵抗菌脂肽產量的各主要影響因素的最佳水平和它們之間的交互情況,并建立了預測模型方程。實驗結果表明,抗菌脂肽預測值的最高產量達到10.7552 g/kg,三個主因素取值分別為:相對濕度87.68%、通氣量12.48m3/

9、min、厚度3.11cm。
　　3.薄層固態(tài)發(fā)酵抗菌脂肽的動力學研究
　　在抗菌脂肽薄層固態(tài)發(fā)酵過程中,定時測定發(fā)酵體系中生物量、抗菌脂肽的產量和還原糖含量等相關指標,通過Origin軟件對數據的處理得到相應的發(fā)酵參數和模型方程。得到最佳發(fā)酵時間為48 h,最小生物量 Cx.0=9.56×106 cfu/g,最大生物量Cx.max=3.20×108 cfu/g,最大比生長速率μm=0.16593 h-1,最小抗菌脂肽產量Cp

10、.0=0.61275 g/kg,最大抗菌脂肽產量Cp.max=10.42448 g/kg,最大比生長速率πm=0.14697 h-1,,最初還原糖量 Cs.0=10.41958,b=0.46058。得到的3個動力學方程皆有高度的擬合度,說明通過它們得到參數具有可靠性,同時為工業(yè)化的大規(guī)模生產提供了理論支持。
　　4.抗菌脂肽對凡納濱對蝦促生長及非特異性免疫指標的影響
　　通過將抗菌脂肽分別按0mg/(kg·feed)(A0對

11、照組)、50mg/(kg·feed)(A1組)、100mg/(kg·feed)(A2組)、150mg/(kg·feed)(A3組)、200mg/(kg·feed)(A4組)的添加量添加到飼料中對對蝦進行喂養(yǎng)試驗。實驗結果表明,抗菌脂肽能顯著促進對蝦的生長和提高對蝦血清和肝胰腺中 POD、AKP、LZM、T-SOD和T-AOC活性,從而提高對蝦的非特異性免疫能力,最終提高了對蝦的抗病能力,最終確定抗菌脂肽的最佳工作濃度為100 mg/(k

12、g·feed)。
　　抗菌脂肽作為水產飼料添加劑的開發(fā)應用,為突破對蝦養(yǎng)殖產業(yè)的病害防控等制約產業(yè)可持續(xù)發(fā)展的瓶頸問題,為促進水產飼料抗病添加劑的更新換代,實現對蝦養(yǎng)殖的綠色化,在源頭上保障對蝦產品的質量安全。
　　5.NT-6抗菌脂肽對凡納濱對蝦養(yǎng)殖源頭弧菌數的影響
　　通過將抗菌脂肽分別按0mg/(kg·feed)(A0對照組)、50mg/(kg·feed)(A1組)、100mg/(kg·feed)(A2組)、20

13、0mg/(kg·feed)(A3組)添加到飼料中對對蝦進行喂養(yǎng)試驗,在對蝦自然養(yǎng)殖環(huán)境和染菌后分別對水體和蝦體中弧菌數的檢測以及檢測對蝦在染菌后的存活率。實驗結果顯示,在對蝦自然養(yǎng)殖環(huán)境中實驗組水體和蝦體中的副溶、溶藻弧菌數均比對照組低且都低于對蝦致病的弧菌數閾值;在染溶藻弧菌后各個實驗組的水體和蝦體中的溶藻弧菌數均在弧菌致病數閾值之上,但各個劑量組中的弧菌數明顯低于對照組,說明抗菌脂肽可以有效抑制水體、蝦體中的弧菌數。
　　芽孢