對蝦特定腐敗菌生物被膜的形成特性及抗菌脂肽的控制作用.pdf

1、凡納濱對蝦營養(yǎng)豐富，一定條件下會促進特定腐敗菌的生長繁殖，對蝦加工環(huán)境為腐敗菌形成生物被膜提供了極其有利的條件。凡納濱對蝦常見的特定腐敗菌又稱為特定腐敗菌（Specific spoilage organisms，SSO）有金黃桿菌、假單胞菌、希瓦氏菌和摩根菌，它們易粘附在食品接觸面甚至在蝦殼表面形成生物被膜，不但會腐蝕設備、形成生物污垢、降低熱傳導效率，更重要的其能成為隱蔽的污染源，造成產品的持續(xù)或交叉污染，縮短貨架期，影響產品的安全性

2、。本研究的目的在于了解凡納濱對蝦常見4種特定腐敗菌形成生物被膜的能力，并從中篩選出成膜能力較強的一株腐敗菌為代表，研究其生物被膜的形成特性和納豆芽孢桿菌的發(fā)酵產物抗菌脂肽AMPNT-6對該菌產生物被膜的控制。研究結果分析如下：
　　以凡納濱對蝦四種特定腐敗菌金黃桿菌（Chryseobacterium）SL-4、假單胞菌（Pseudoalteromonas）SL-1、腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）SL

3、-3、摩根菌（Morganella）SL-11為研究對象，采用試管結晶紫染色法，研究不同培養(yǎng)基、接觸面對腐敗菌生物被膜形成的影響，利用96微孔法研究不同菌株之間形成生物被膜的情況，通過普通光學顯微鏡觀察玻片上生物被膜的黏附情況，并用掃描電鏡觀察不同接觸面上腐敗菌生物被膜的結構特性。結果表明，在 LB、TSB、BHI培養(yǎng)基中，形成生物被膜OD600值最大的是假單胞菌，其余依次為金黃桿菌、希瓦氏菌、摩根菌；并且四種腐敗菌在LB培養(yǎng)基中形成生

4、物被膜的量均較多，其次是在BHI培養(yǎng)基中，在 TSB中形成生物被膜的能力相對最低；在聚乙烯塑料片上，生物被膜的形成能力強弱依次為假單胞菌、希瓦氏菌、金黃桿菌、摩根菌；在不銹鋼片上，生物被膜形成能力強弱依次是希瓦氏菌、假單胞菌、金黃桿菌、摩根菌。顯微鏡觀察發(fā)現假單胞菌和希瓦氏菌在玻片上粘附面積較大，而且比較致密，金黃桿菌和摩根菌相對而言較為松散。同時在掃描電鏡下觀察到，在聚乙烯塑料片上，假單胞菌和希瓦氏菌形成致密的矩陣狀被膜組織，并有微孔

5、洞鑲嵌在被膜上；在不銹鋼片上，金黃桿菌也形成矩陣狀被膜組織，希瓦氏菌形成多層次的較為致密的網絡狀被膜結構；其它腐敗菌均相互粘附且較為松散。多種腐敗菌共同培養(yǎng)形成生物被膜的能力較單一菌種的形成能力強的強，腐敗希瓦氏菌能促進其它菌株的成膜能力。綜合評估，發(fā)現希瓦氏菌在LB培養(yǎng)基中于不銹鋼片上形成生物被膜的能力最強，確定希瓦氏菌為為下一步試驗菌株。
　　采用改良的96微孔板法，通過改變環(huán)境因素，研究不同培養(yǎng)時間、菌體濃度和不同理化因子、

6、幾種脅迫條件對腐敗希瓦氏菌生物被膜形成能力的影響；并分別通過玻璃試管法研究不同基質及其濃度對希瓦氏菌成膜能力的影響；利用掃描電鏡觀察以不銹鋼片為接觸面對希瓦氏菌生物被膜形態(tài)結構的影響。結果顯示，希瓦氏菌在 LB培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)約24h形成成熟的生物被膜；在各實驗條件下，分別以30℃培養(yǎng)，2％NaCl濃度，pH為中性或略偏堿性，起始菌濃度為106-107CFU/mL時形成生物被膜的量最大。希瓦氏菌在不銹鋼片上形成成熟的生物被膜需要60h，

7、掃描電鏡觀察其形態(tài)為立體網絡狀結構，被膜上鑲嵌有微孔道，內部呈有規(guī)律的褶皺結構?；|的濃度和種類也會影響希瓦氏菌生物被膜的形成，如質量濃度在20%以內，希瓦氏菌在LB、蝦汁液中形成生物被膜的能力無顯著差異，但濃度高于20%時，希瓦氏菌更容易在蝦汁液中形成生物被膜。而Ca2+和一定濃度的Mg2+會抑制腐敗希瓦氏菌生物被膜的形成；葡萄糖的添加量對生物被膜的形成沒有明顯的影響。幾種脅迫條件如抗菌劑（75%酒精、H2O2、84消毒液、乙酸）的存

8、在對希瓦氏菌的成膜能力無顯著影響，但0.3%的NaClO會促進生物被膜的形成。
　　牛津杯試驗發(fā)現納豆芽孢桿菌的發(fā)酵產物抗菌脂肽AMPNT-6對腐敗希瓦氏菌有較好的抑菌活性，抑菌圈能到達（23.14±1.43）mm，MIC值為0.3125mg/mL。采用試管結晶紫染色法可以得知AMPNT-6對不銹鋼片、蝦殼上的生物被膜均有較好的控制作用，其中抗粘附效果較清除作用好，2MIC的AMPNT-6即可對將生物被膜控制在較低的水平。微孔試驗

9、研究得出：2MIC的AMPNT-6作用3h即可很好的抑制生物被膜的形成，作用24h達到最佳的清除效果。
　　初始階段加入 AMPNT-6，其主要作用于菌體，達到抗粘附的效果；生物被膜成熟后加入 AMPNT-6，其主要對胞外多聚物發(fā)生作用，達到對生物被膜的清除效果。掃描電鏡圖顯示抗粘附的過程中，AMPNT-6可以使菌體破損及阻止細菌的粘附來抑制被膜的形成；清除的過程中，AMPNT-6會破壞生物被膜的組織結構，使被膜發(fā)生脫落。3MIC