豬肝羧酸酯酶1水解磺胺類藥物的特性研究.pdf

1、豬肝羧酸酯酶(Pig liver esterase，PLE)，屬于絲氨酸蛋白酶，是由多種同工酶組成的酶家族，其中豬肝羧酸酯酶1(PLE1)含量較高，是該家族的重要成員。PLE具有高度的水解活性和立體選擇性，成為有機(jī)合成中主要的水解酶之一。但PLE作為藥物代謝酶的角色，在豬的藥物代謝和解毒中是否發(fā)揮作用尚未見(jiàn)報(bào)道。據(jù)其在有機(jī)化學(xué)合成中顯示出的強(qiáng)大水解活性，以及人類CES顯示出的重要藥物代謝和解毒作用，推測(cè)PLE可能在豬用藥物代謝中發(fā)揮不可

2、忽視的作用，并由此影響藥物的療效和毒副作用，因此，本課題擬研究PLE1是否水解臨床獸藥、水解特點(diǎn)及機(jī)制，為豬臨床合理用藥提供必要的理論依據(jù)，具有重要的理論和實(shí)踐意義。
　　本課題在功能性表達(dá)PLE1的基礎(chǔ)上，首先通過(guò)PLE1的體外水解抑制試驗(yàn)，快速檢測(cè)了83種臨床上常用的各種類型獸藥對(duì)PLE1水解p-NPA的抑制作用，以篩選獲得可能被PLE1水解的獸藥種類;測(cè)定了獸藥對(duì)PLE1的抑制常數(shù)，以確定抑制類型，進(jìn)一步預(yù)測(cè)藥物被PLE1水

3、解的可能性;建立高效液相色譜(HPLC)及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)等儀器分析方法，定量檢測(cè)PLE1對(duì)獸藥的水解，確定獸藥是否被PLE1水解，分析PLE1對(duì)獸藥的米氏常數(shù)與藥物對(duì)PLE1的抑制常數(shù)的相關(guān)性，以佐證結(jié)果的可信度;最后，跟據(jù)人的CES晶體結(jié)構(gòu)，建立PLE1同源模型，將獸藥分子與之對(duì)接，闡明PLE1催化水解獸藥的機(jī)理。具體研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.藥物抑制PLE1水解p-NPA的情況
　　測(cè)定了83

4、種獸醫(yī)臨床常用藥物（化學(xué)合成抗菌藥、抗生素、抗真菌藥物、抗寄生蟲(chóng)藥物、解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥、局麻藥物）對(duì)PLE1水解p-NPA的抑制作用，結(jié)果只發(fā)現(xiàn)抗生素和化學(xué)合成抗菌藥中的某些藥物具有不同程度的抑制作用，如屬于抗生素的泰樂(lè)菌素顯著抑制PLE1的水解活性(0.01＜P＜0.05);化學(xué)合成抗菌藥中的磺胺類藥物酞磺噻唑(PST)與磺胺異惡唑(SIZ)極顯著抑制PLE1的水解活性(P＜0.01)，磺胺氯噠嗪(SCP)顯著抑制PLE1的水解活性(0

5、.01＜P＜0.05)。
　　2.HPLC測(cè)定PLE1對(duì)泰樂(lè)菌素的水解
　　建立泰樂(lè)菌素的HPLC定量方法，測(cè)定經(jīng)PLE1水解前后泰樂(lè)菌素濃度的變化。結(jié)果顯示泰樂(lè)菌素并未被PLE1所水解，說(shuō)明僅憑對(duì)PLE1的水解產(chǎn)生抑制作用的結(jié)果不能預(yù)測(cè)獸藥是否是PLE1的適宜底物，結(jié)合抑制作用類型的確定可望提供進(jìn)一步的參考。
　　3.磺胺類藥物對(duì)PLE1抑制類型的確定
　　以p-NPA為底物，測(cè)定并計(jì)算了24種磺胺類藥物對(duì)PL

6、E1水解的抑制常數(shù)，發(fā)現(xiàn)不同的磺胺類藥物對(duì)PLE1的抑制常數(shù)不同，但各磺胺類藥物的Alpha值均大于1，顯示磺胺類藥物抑制PLE1水解的類型均為競(jìng)爭(zhēng)性抑制，即這24種磺胺類藥物和通用底物p-NPA與PLE1結(jié)合的位點(diǎn)相同，提示磺胺類藥物很有可能被PLE1催化水解。
　　查詢Pub Chem Compound網(wǎng)站獲取24種磺胺類藥物的分配系數(shù)XlogP值，將XlogP值與log Ki值進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)兩者呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性，即在

7、一定范圍內(nèi)(XlogP值為0.1-1.5)，隨著XlogP值的不斷增大，logKi值出現(xiàn)先降后升的趨勢(shì)，并在XlogP=1.0時(shí)，達(dá)到最低值，即抑制程度最大。說(shuō)明磺胺類藥物對(duì)PLE1的抑制與其結(jié)構(gòu)（分配系數(shù)）有關(guān)。
　　4.LC-MS/MS測(cè)定PLE1對(duì)磺胺類的降解作用
　　建立了檢測(cè)磺胺類藥物的LC-MS/MS方法，采用乙腈與0.1％的甲酸水作為流動(dòng)相，通過(guò)梯度洗脫使藥物得到良好的分離，使用全掃描方式對(duì)藥物進(jìn)行定量定性分析

8、。大部分磺胺類藥物在1～32ppb范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r≥0.999)。測(cè)定了PLE1對(duì)不同濃度下的24種磺胺類藥物的降解速度，計(jì)算了PLE1對(duì)24種磺胺類藥物的米氏常數(shù)Km與催化降解的最大反應(yīng)速率Vmax。結(jié)果表明，絕大多數(shù)磺胺類藥物濃度在PLE1作用下有明顯降低，說(shuō)明PLE1對(duì)絕大多數(shù)磺胺類藥物有明顯的催化降解作用。對(duì)磺胺類藥物的logKm值與log Ki值進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)log Km值與log Ki值顯著正相關(guān)(0.01＜P＜

9、0.05)，說(shuō)明不同磺胺類藥物與PLE1的親和性越大，其對(duì)PLE1催化水解通用底物的抑制越明顯，反之亦然。
　　5.同源模建及分子對(duì)接
　　構(gòu)建了PLE1三聚體及單體的3D結(jié)構(gòu)模型，并與不同的磺胺類藥物進(jìn)行分子對(duì)接。結(jié)果顯示，磺胺類藥物與PLE1活性中心的結(jié)合方式與其通用底物p-NPA類似，磺胺類藥物分子中的硫原子可能扮演了p-NPA中的羰基碳原子的角色。對(duì)PLE1有抑制作用的磺胺類藥物與酶的結(jié)合能量普遍低于酶與通用底物(p