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文檔簡介
1、豬肝羧酸酯酶(Pig liver esterase,PLE),屬于絲氨酸蛋白酶,是由多種同工酶組成的酶家族,其中豬肝羧酸酯酶1(PLE1)含量較高,是該家族的重要成員。PLE具有高度的水解活性和立體選擇性,成為有機合成中主要的水解酶之一。但PLE作為藥物代謝酶的角色,在豬的藥物代謝和解毒中是否發(fā)揮作用尚未見報道。據(jù)其在有機化學(xué)合成中顯示出的強大水解活性,以及人類CES顯示出的重要藥物代謝和解毒作用,推測PLE可能在豬用藥物代謝中發(fā)揮不可
2、忽視的作用,并由此影響藥物的療效和毒副作用,因此,本課題擬研究PLE1是否水解臨床獸藥、水解特點及機制,為豬臨床合理用藥提供必要的理論依據(jù),具有重要的理論和實踐意義。
本課題在功能性表達(dá)PLE1的基礎(chǔ)上,首先通過PLE1的體外水解抑制試驗,快速檢測了83種臨床上常用的各種類型獸藥對PLE1水解p-NPA的抑制作用,以篩選獲得可能被PLE1水解的獸藥種類;測定了獸藥對PLE1的抑制常數(shù),以確定抑制類型,進(jìn)一步預(yù)測藥物被PLE1水
3、解的可能性;建立高效液相色譜(HPLC)及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)等儀器分析方法,定量檢測PLE1對獸藥的水解,確定獸藥是否被PLE1水解,分析PLE1對獸藥的米氏常數(shù)與藥物對PLE1的抑制常數(shù)的相關(guān)性,以佐證結(jié)果的可信度;最后,跟據(jù)人的CES晶體結(jié)構(gòu),建立PLE1同源模型,將獸藥分子與之對接,闡明PLE1催化水解獸藥的機理。具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
1.藥物抑制PLE1水解p-NPA的情況
測定了83
4、種獸醫(yī)臨床常用藥物(化學(xué)合成抗菌藥、抗生素、抗真菌藥物、抗寄生蟲藥物、解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥、局麻藥物)對PLE1水解p-NPA的抑制作用,結(jié)果只發(fā)現(xiàn)抗生素和化學(xué)合成抗菌藥中的某些藥物具有不同程度的抑制作用,如屬于抗生素的泰樂菌素顯著抑制PLE1的水解活性(0.01<P<0.05);化學(xué)合成抗菌藥中的磺胺類藥物酞磺噻唑(PST)與磺胺異惡唑(SIZ)極顯著抑制PLE1的水解活性(P<0.01),磺胺氯噠嗪(SCP)顯著抑制PLE1的水解活性(0
5、.01<P<0.05)。
2.HPLC測定PLE1對泰樂菌素的水解
建立泰樂菌素的HPLC定量方法,測定經(jīng)PLE1水解前后泰樂菌素濃度的變化。結(jié)果顯示泰樂菌素并未被PLE1所水解,說明僅憑對PLE1的水解產(chǎn)生抑制作用的結(jié)果不能預(yù)測獸藥是否是PLE1的適宜底物,結(jié)合抑制作用類型的確定可望提供進(jìn)一步的參考。
3.磺胺類藥物對PLE1抑制類型的確定
以p-NPA為底物,測定并計算了24種磺胺類藥物對PL
6、E1水解的抑制常數(shù),發(fā)現(xiàn)不同的磺胺類藥物對PLE1的抑制常數(shù)不同,但各磺胺類藥物的Alpha值均大于1,顯示磺胺類藥物抑制PLE1水解的類型均為競爭性抑制,即這24種磺胺類藥物和通用底物p-NPA與PLE1結(jié)合的位點相同,提示磺胺類藥物很有可能被PLE1催化水解。
查詢Pub Chem Compound網(wǎng)站獲取24種磺胺類藥物的分配系數(shù)XlogP值,將XlogP值與log Ki值進(jìn)行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)兩者呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性,即在
7、一定范圍內(nèi)(XlogP值為0.1-1.5),隨著XlogP值的不斷增大,logKi值出現(xiàn)先降后升的趨勢,并在XlogP=1.0時,達(dá)到最低值,即抑制程度最大。說明磺胺類藥物對PLE1的抑制與其結(jié)構(gòu)(分配系數(shù))有關(guān)。
4.LC-MS/MS測定PLE1對磺胺類的降解作用
建立了檢測磺胺類藥物的LC-MS/MS方法,采用乙腈與0.1%的甲酸水作為流動相,通過梯度洗脫使藥物得到良好的分離,使用全掃描方式對藥物進(jìn)行定量定性分析
8、。大部分磺胺類藥物在1~32ppb范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r≥0.999)。測定了PLE1對不同濃度下的24種磺胺類藥物的降解速度,計算了PLE1對24種磺胺類藥物的米氏常數(shù)Km與催化降解的最大反應(yīng)速率Vmax。結(jié)果表明,絕大多數(shù)磺胺類藥物濃度在PLE1作用下有明顯降低,說明PLE1對絕大多數(shù)磺胺類藥物有明顯的催化降解作用。對磺胺類藥物的logKm值與log Ki值進(jìn)行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)log Km值與log Ki值顯著正相關(guān)(0.01<P<
9、0.05),說明不同磺胺類藥物與PLE1的親和性越大,其對PLE1催化水解通用底物的抑制越明顯,反之亦然。
5.同源模建及分子對接
構(gòu)建了PLE1三聚體及單體的3D結(jié)構(gòu)模型,并與不同的磺胺類藥物進(jìn)行分子對接。結(jié)果顯示,磺胺類藥物與PLE1活性中心的結(jié)合方式與其通用底物p-NPA類似,磺胺類藥物分子中的硫原子可能扮演了p-NPA中的羰基碳原子的角色。對PLE1有抑制作用的磺胺類藥物與酶的結(jié)合能量普遍低于酶與通用底物(p
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