磺胺類藥物殘留酶免疫分析的研究.pdf

1、磺胺類藥物是獸醫(yī)臨床上使用最廣的一類化學(xué)合成抗菌藥,主要用于細(xì)菌感染性疾病和某些原蟲病的預(yù)防和治療.但使用不合理很容易造成組織中的殘留和蓄積.許多國(guó)家和組織規(guī)定了其最高殘留限量(MRLs)為0.1μg/g,甚至不得檢出.高效液相色譜、氣-質(zhì)聯(lián)用等是磺胺類藥物殘留檢測(cè)的法定方法,但成本較高,方法繁瑣,不適于大量樣本的測(cè)定.酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè)具有特異性強(qiáng)、靈敏度好且適合大批樣本快速測(cè)定的特點(diǎn),在獸藥殘留檢測(cè)上的應(yīng)用日益廣泛.關(guān)于各

2、磺胺類藥物殘留免疫法檢測(cè)的研究已有較多報(bào)道,但關(guān)于磺胺類藥多殘留(multi-residues)檢測(cè)的研究才剛剛起步,而且在理論和實(shí)踐中有許多問題需要解決.該研究通過化學(xué)法合成了兩種具有磺胺母核結(jié)構(gòu)的半抗原,制備了對(duì)多種磺胺藥具有敏感性的多克隆抗體,并對(duì)多殘留免疫分析的基本規(guī)律進(jìn)行了探討.另外,研制了磺胺甲基異噁唑(SMZ)抗體,建立了SMZ的ELISA檢測(cè)方法,并應(yīng)用于牛奶中SMZ殘留的檢測(cè).用對(duì)乙酰氨基苯磺酰氯(ASC)和對(duì)氨基苯甲

3、酸(PABA)為反應(yīng)原料,經(jīng)過親核取代、水解等化學(xué)反應(yīng),合成了保留磺胺藥母核結(jié)構(gòu)的半抗原化合物H1、H2,經(jīng)紫外掃描、紅外光譜、質(zhì)譜、核磁共振以及免疫法鑒定為預(yù)期產(chǎn)物.用活性酯法和混合酸酐法將半抗原與載體蛋白偶聯(lián),制備了人工抗原,兩種免疫原H1-HSA、H1-BSA的結(jié)合比分別為10.3:1和9.6:l.用H1-HSA偶聯(lián)物免疫兔子,制備了抗磺胺類藥物抗體,抗體效價(jià)在1:l0萬(wàn)以上.間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA表明,5種常用的磺胺藥SQ、SMM、

4、SMD、SMZ、SC的檢測(cè)限分別為0.065、0.046、0.045、0.032、0.015μg.ml,低于最高殘留限量0.1 μg.ml.但SD、SM<,2>的檢測(cè)限較高為0.86、1.0μg/ml.抗體有較高的特異性,常用的4種抗生素和3種磺胺類藥結(jié)構(gòu)類似物與抗體無(wú)交叉反應(yīng),制備了酶標(biāo)半抗原,并進(jìn)行了直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA試驗(yàn).試驗(yàn)結(jié)果表明磺胺藥N 1端R取代基的空間位阻、電子云和電荷的分布與密度是決定抗體識(shí)別藥物的重要因素.在牛奶介質(zhì)

5、中各藥物的檢測(cè)效果優(yōu)于PBS介質(zhì)中,添加SQ的回收率為76.5％~107.4％,建立的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法基本能滿足磺胺藥多殘留定性檢測(cè)的要求.用戊二醛將SMZ與載體偶聯(lián),以SMZ-BSA為免疫原制備了多克隆抗體和單克隆抗體.多克隆抗體具有較高的檢測(cè)靈敏度和特異性,以其建立了測(cè)定SMZ殘留的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法.以SMZ濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),藥物對(duì)抗原抗體反應(yīng)的抑制率為縱坐標(biāo),繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線.經(jīng)計(jì)算,該方法的檢測(cè)限是8.74ng/ml,