苯二氮卓類藥物殘留免疫分析方法的研究.pdf

1、本研究旨在研究快速檢測(cè)苯二氮卓類(BZD)的間接酶聯(lián)免疫(ELISA)方法和競(jìng)爭(zhēng)性膠體金免疫層析方法。實(shí)驗(yàn)選擇了硝西泮(NZP)、氯硝西泮(CZP)和地西泮(DZP)作為研究對(duì)象，首先對(duì)三種物質(zhì)分別進(jìn)行衍生化，合成相應(yīng)的半抗原：再將半抗原分別與牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，BSA)和卵清白蛋白(ovalbumin，OVA)交聯(lián)，制備成免疫抗原和包被抗原；將得到的免疫原免疫新西蘭白兔，每種免疫原免疫2只兔子，5次免疫

2、后測(cè)定每只兔子抗血清的效價(jià)，并選擇效價(jià)高的血清供后面實(shí)驗(yàn)用。 設(shè)計(jì)了檢測(cè)NZP的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，并優(yōu)化稀釋緩沖液、pH、競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間等實(shí)驗(yàn)條件確定最終的ELISA檢測(cè)系統(tǒng)。該間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的IC50為1.531ng/mL，LOD為0.081ng/mL，檢測(cè)范圍在0.17～13.8ng/mL，NZP尿樣中的回收率在62.8％～85.6％之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于5.67％，抗NZP的抗體對(duì)分子結(jié)構(gòu)相似的氯硝西泮，地西泮和2

3、種代謝物7-氨基硝西泮、7-氨基氯硝西泮都具有交叉反應(yīng)，但對(duì)其他類鎮(zhèn)靜類藥物如鹽酸異丙嗪等則具有較好的特異性，交叉反應(yīng)率均≤0.1％。 本研究還設(shè)計(jì)了檢測(cè)NZP競(jìng)爭(zhēng)性膠體金免疫層析試紙條，采用檸檬酸三鈉還原法制備了18.6nm左右的膠體金溶液。在標(biāo)記NZP多克隆抗體時(shí)，最佳pH值為9，最適標(biāo)記抗體濃度為20μg/mL。選用Millipore公司的M135硝酸纖維膜，上海金標(biāo)有限公司的VL78玻璃纖維膜為金標(biāo)墊，SB06玻璃纖維膜

4、為樣品墊，吸水紙，PVC底板組裝成試紙條。其中每金標(biāo)墊上噴涂60μL金標(biāo)抗體，檢測(cè)線和質(zhì)控線分別用0.5mg/mL的NZP包被抗原和0.2mg/mL的羊抗兔IgG二抗。用試紙條檢測(cè)NZP標(biāo)準(zhǔn)溶液，檢測(cè)限為150ng/mL。 本研究所建立的檢測(cè)NZP的間接ELISA方法的各項(xiàng)參數(shù)都達(dá)到了國(guó)外試劑盒的指標(biāo)和要求，可用于實(shí)際檢測(cè)；本研究的膠體金免疫層析試紙條實(shí)驗(yàn)為NZP膠體金試紙條的深入研究提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也對(duì)食品中其它小分子獸