苯噻菌酯殘留免疫分析方法研究.pdf

1、苯噻菌酯（benzothiostrobin）是由華中師范大學(xué)研發(fā)的一種新型甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑。苯噻菌酯具有殺菌譜廣，殺菌活性高，施用量低，持效期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，具有保護(hù)及治療作用，對(duì)作物白粉病、霜霉病均表現(xiàn)出優(yōu)越的防效，具有良好的市場(chǎng)開(kāi)發(fā)前景。為了進(jìn)一步研究苯噻菌酯的安全使用、殘留控制及最大殘留限量（MRL）的確定，本研究建立了能定量檢測(cè)苯噻菌酯的高效液相色譜分析方法，同時(shí)依據(jù)苯噻菌酯特異性單克隆抗體，建立了酶聯(lián)免疫分析和免疫層析分析方法

2、。
　　采用高效液相色譜法，使用C18反相色譜柱，以乙腈-三氟乙酸水溶液(65∶35，V/V)為流動(dòng)相，流速為0.8 mL/min，在UV230 nm下，對(duì)苯噻菌酯進(jìn)行定量測(cè)定。在0.1～10 mg/L范圍內(nèi)，苯噻菌酯濃度與色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9999，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.332％，平均回收率為102.7％。
　　通過(guò)對(duì)苯噻菌酯進(jìn)行水解合成了苯噻菌酯半抗原，將苯噻菌酯半抗原與牛血清蛋白(BSA)偶聯(lián)制備了

3、免疫原，與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)制備了包被抗原。經(jīng)紫外光譜分析證明人工抗原偶聯(lián)成功，免疫原和包被原的結(jié)合比分別為17∶1和8∶1。免疫BALB/c小鼠獲得相應(yīng)的單克隆抗體。當(dāng)包被抗原的濃度為4 mg/L時(shí)，單克隆抗體的效價(jià)達(dá)到6.3×106。
　　利用制備的特異性單克隆抗體建立了能夠用于檢測(cè)苯噻菌酯殘留的酶聯(lián)免疫分析方法。通過(guò)對(duì)工作濃度、甲醇含量、離子強(qiáng)度、pH值的優(yōu)化，確定了抗原抗體的最佳反應(yīng)條件。在最佳優(yōu)化條件下（5％甲醇PB

4、S溶液、Na+0.3 M、pH6.5），該方法檢測(cè)苯噻菌酯的抑制中濃度(IC50)和最低檢測(cè)濃度(ICl0)為7.55和0.428μg/L。建立的ic-ELISA除了對(duì)吡唑醚菌酯有交叉反應(yīng)外(0.34％)，與苯噻菌酯結(jié)構(gòu)類(lèi)似化合物沒(méi)有明顯的交叉反應(yīng)。稻田水、土壤、番茄、大米和梨中的平均添加回收率為80.43～113.83％，滿足苯噻菌酯殘留檢測(cè)要求。真實(shí)樣品的檢測(cè)結(jié)果表明ELISA與高效液相色譜法具有高度的相關(guān)性(y=1.0867x+0

5、.0318，R2=0.9894)。證明建立的ic-ELISA能夠高靈敏地檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境樣品中苯噻菌酯的殘留。
　　在金標(biāo)抗體和最優(yōu)半抗原的基礎(chǔ)上，制備了免疫層析試紙條，并建立了一種可以快速（5分鐘）、簡(jiǎn)便的檢測(cè)不同樣品中苯噻菌酯的免疫層析分析方法(ICA)。在最優(yōu)條件下，所建立的ICA對(duì)苯噻菌酯的100％抑制濃度為0.1 mg/L，最低檢測(cè)限0.05mg/L。通過(guò)對(duì)7種甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑交叉反應(yīng)的研究，建立的ICA對(duì)苯噻菌酯