紅麻atp9、atp6、atpA基因克隆、功能分析與分子標(biāo)簽發(fā)掘.pdf

1、發(fā)掘克隆紅麻細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)基因,是闡明CMS分子機(jī)理的關(guān)鍵。紅麻CMS機(jī)理研究為創(chuàng)制新的CMS系提供研究手段,同時(shí)為雜種優(yōu)勢(shì)利用提供理論依據(jù)。本研究以紅麻CMS系P3A、保持系P3B以及F1代為材料,采用同源克隆與hiTAIL-PCR方法克隆線粒體能量代謝基因atp6、atp9、atpA全長(zhǎng),通過序列比對(duì),找出了材料間3個(gè)能量代謝基因的差異;為了進(jìn)一步確認(rèn)紅麻CMS系存在的差異片段是否與雄性不育相關(guān),將atp9的3’端的差異區(qū)域構(gòu)建

2、植物表達(dá)載體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草進(jìn)行功能驗(yàn)證;基于紅麻CMS系中atp9和atp6存在的差異片段,開發(fā)了兩個(gè)能特異區(qū)別紅麻野敗型UG93細(xì)胞質(zhì)的PCR分子標(biāo)簽,并對(duì)104份紅麻資源進(jìn)行驗(yàn)證;同時(shí),分析atp6、atp9、atpA基因的差異表達(dá)和CDS區(qū)的RNA編輯模式,找出這3個(gè)能量代謝基因的差異表達(dá)與異常編輯位點(diǎn)。獲得的主要結(jié)果如下:
　　1、采用同源與hiTAIL-PCR方法克隆atp9基因全長(zhǎng),紅麻CMS系P3A中at

3、p9全長(zhǎng)為1215bp,而相應(yīng)的保持系P3B為1262bp,通過序列比對(duì),CMS系P3A中的atp9的3’端發(fā)生了47bp的缺失;進(jìn)而分析atp9基因在紅麻CMS系,保持系以及F1代花藥雙核期中差異表達(dá),CMS系atp9的表達(dá)水平是其保持系的0.937倍,而F1代是其保持系的1.59倍。
　　2、采用同源與hiTAIL-PCR方法克隆atp6基因全長(zhǎng),紅麻CMS系P3A中atp6全長(zhǎng)為4892bp,而相應(yīng)的保持系P3B為4922b

4、p,通過序列比對(duì),CMS系P3A中的atp6的CDS區(qū)缺失33bp和插入3bp,進(jìn)而分析atp6基因在紅麻CMS系,保持系以及F1代花藥雙核期中差異表達(dá),CMS系atp6的表達(dá)水平是其保持系的0.963倍,F1代是其保持系的0.987倍。
　　3、采用同源與hiTAIL-PCR方法克隆atpA基因全長(zhǎng),紅麻CMS系P3A及相應(yīng)保持系P3B中的atpA全長(zhǎng)均為3194bp,兩者不存在顯著的片段差異,只存在堿基之間的差異;進(jìn)而分析at

5、pA基因在紅麻CMS系,保持系以及F1代的花藥雙核期中差異表達(dá),CMS系atpA的表達(dá)水平是其保持系的0.760倍,而F1代是其保持系的1.87倍。
　　4、紅麻線粒體基因atp9,atp6,atpA的CDS區(qū)RNA編輯模式以紅麻同質(zhì)異核型的5個(gè)CMS系K03A,722A,917A,F3A,P3A和同核異質(zhì)型的CMS系與相應(yīng)保持系為材料,分析atp9的CDS區(qū)RNA編輯模式。結(jié)果顯示這些材料擁有7個(gè)相同的編輯位點(diǎn)(第59th,89

6、th,221th,230th,254th,262th和282 th位點(diǎn)),全部為C-U轉(zhuǎn)變,編輯頻率為61.5％-100%,第262th位點(diǎn)均創(chuàng)建了一個(gè)新的終止密碼子,形成PvuI特異酶切位點(diǎn),酶切圖譜顯示該位點(diǎn)為完全編輯。這些同質(zhì)異核或同核異質(zhì)型材料除了擁有相同的編輯位點(diǎn)外,不同材料還擁有各自的特異完全編輯位點(diǎn),材料間相同編輯位點(diǎn)不存在明顯差異,而特異100%編輯位點(diǎn)存在明顯的差異,其中722B,917B,F3B,P3B這4個(gè)保持系較

7、不育系具有更多的特異100%編輯位點(diǎn),這些規(guī)律更易于解釋育性正常的材料傾向于完全編輯。此外,以紅麻不育系P3A,保持系P3B和雜交F1為材料,分析了atp6,atpA基因CDS區(qū)RNA編輯模式。結(jié)果顯示atp6的CDS區(qū)發(fā)生了43個(gè)位點(diǎn)編輯,其中18個(gè)發(fā)生C-U堿基轉(zhuǎn)換,其余的發(fā)生 A-G,T-C,A-U,G-A新的編輯形式;在這43個(gè)位點(diǎn)編輯中,其中34個(gè)作用于密碼子的第1、第2位點(diǎn)上,另外3個(gè)為共同編輯位點(diǎn),導(dǎo)致37個(gè)氨基酸發(fā)生轉(zhuǎn)變

8、;atpA基因CDS區(qū)發(fā)生了36個(gè)位點(diǎn)編輯,僅有10個(gè)發(fā)生C-U堿基轉(zhuǎn)換,其余的發(fā)生A-G,T-C,A-U,G-A,G-U,A-C,G-C新的編輯形式;在這36個(gè)位點(diǎn)編輯中,28個(gè)作用于密碼子的第1、第2位點(diǎn)上,導(dǎo)致24個(gè)氨基酸發(fā)生轉(zhuǎn)變;同時(shí),atp9、atp6、atpA基因RNA編輯常導(dǎo)致氨基酸發(fā)生轉(zhuǎn)變,結(jié)果顯示色氨酸(S)更易于發(fā)生RNA編輯,且易于轉(zhuǎn)變成亮氨酸(L)和苯丙氨酸(F)。這些氨基酸性質(zhì)的改變多由親水型轉(zhuǎn)變成疏水型。此外

9、,因F1的恢復(fù)基因(Rfs)引入,atp6編輯位點(diǎn)數(shù)量及編輯頻率都呈遞增趨勢(shì),在編輯的過程中產(chǎn)生了新的終止密碼子。
　　5、基于紅麻CMS系中atp9的3’端存在片段差異,構(gòu)建了4個(gè)植物表達(dá)載體,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草進(jìn)行功能驗(yàn)證。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化載體MTS-HM184-GFP和MTS-HM184的陽(yáng)性植株中出現(xiàn)了不育表型。所有轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株中,一些表現(xiàn)為雄性不育和半不育,另一些表現(xiàn)為可育;目的基因在雄性不育植株中有較高的表達(dá)量,在

10、可育植株中不表達(dá)或微量表達(dá),而在半不育植株中的表達(dá)量介于兩者之間。轉(zhuǎn)化載體MTS-HM184-GFP的不育植株表現(xiàn)為花藥不正常,花粉粒干癟,碘染不正常著色,果實(shí)干癟,種子發(fā)芽率為0%。轉(zhuǎn)化載體MTS-HM184-GFP和MTS-HM184的半不育植株,花藥外形正常,碘染正常著色花粉粒為10–50%,果實(shí)不飽滿,發(fā)芽率為58%。這些在育性上發(fā)生改變的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株,在農(nóng)藝性狀上也存在差異,苗期出現(xiàn)了變態(tài)葉,株高均較野生型植株矮,且生育期足

11、足延后了30-45天。采用絕對(duì)熒光定量方法對(duì)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株中的目的基因拷貝數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,導(dǎo)入MTS-HM184-GFP的陽(yáng)性單株分別檢測(cè)到1和2個(gè)拷貝的目的基因;導(dǎo)入載體MTS-HM184陽(yáng)性單株均檢測(cè)到3個(gè)拷貝的目的基因;而在野生型植株中未檢測(cè)到目的基因。這些初步的研究結(jié)果顯示,紅麻嵌合基因HM184可能與紅麻雄性不育相關(guān)。
　　6、基于紅麻CMS系中atp9和atp6存在的差異,開發(fā)了兩個(gè)能特異區(qū)別紅麻野敗型UG93細(xì)