奶牛MIC1表達(dá)檢測(cè)及其在主要組織細(xì)胞分布研究.pdf

1、繁殖是奶牛產(chǎn)業(yè)中最重要的環(huán)節(jié)。奶牛繁殖不僅影響著奶牛的數(shù)量和質(zhì)量，還與奶牛的生產(chǎn)性能及經(jīng)濟(jì)效益密切相關(guān)。各種原因造成的早期胚胎流失，特別是著床期胚胎流失是奶牛繁殖失敗最主要原因。其中，母胎界面的“同種半導(dǎo)體免疫”在胚胎著床中至關(guān)重要。主要組織相容性復(fù)合體通過(guò)直接或間接免疫，影響配子品質(zhì)和胚胎發(fā)育。MHC-Ⅰ蛋白的正常表達(dá)在動(dòng)物妊娠建立、維持和分娩中具有決定性的免疫調(diào)節(jié)作用。
　　 奶牛主要組織相容性復(fù)合體Ⅰα鏈相關(guān)蛋白(MIC1

2、)屬于非典型MHC-Ⅰ，是自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)受體NKG2D的配體，位于第23號(hào)染色體的MHC-Ⅰ區(qū)域內(nèi)。MIC1蛋白在上皮細(xì)胞、移植細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中表達(dá);熱應(yīng)激可激發(fā)上皮細(xì)胞表達(dá)MIC1蛋白。MIC1蛋白的表達(dá)將激活NK細(xì)胞，MIC1只有與NKG2D受體結(jié)合才能激活NK細(xì)胞殺傷活性。IFN-τ屬于Ⅰ型干擾素家族，是反芻動(dòng)物胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌產(chǎn)生的一類糖蛋白，具有維持黃體功能、建立正常妊娠、傳遞早期胚胎信號(hào)等功能，在胚胎著床過(guò)程中發(fā)

3、揮重要作用?；谶@些特點(diǎn)，我們推測(cè)IFN-τ對(duì)奶牛子宮上皮細(xì)胞MIC1的表達(dá)具有調(diào)控作用。
　　 本研究通過(guò)重組DNA和基因表達(dá)技術(shù)，利用制備的兔抗牛MIC1多克隆抗體，采用Western blot及免疫組織化學(xué)方法研究了MIC1蛋白在奶牛主要組織以及奶牛子宮上皮細(xì)胞上的表達(dá)及分布情況，為今后進(jìn)一步開展奶牛子宮上皮細(xì)胞上表達(dá)MIC1功能研究及應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。本研究取得的主要結(jié)果如下:
　　 1.奶牛MIC1的克隆

4、>　　 根據(jù)Genbank的MIC1的CDS序列，設(shè)計(jì)了一對(duì)引物。以奶牛子宮組織為材料提取總RNA;應(yīng)用RT-PCR擴(kuò)增MIC1 CDS序列;瓊脂糖凝膠電泳顯示目的片段大小約為896bp;對(duì)所得到的MIC1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別用Bam H（I）和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定及序列測(cè)定，與GenBank中登錄號(hào)為NM001127317.1的奶牛MIC1基因同源性為98％，氨基酸同源性為100％。
　　 2.奶牛MIC1的克隆與表達(dá)

5、r>　　 利用PCR克隆得到MIC1片段，將目的基因分別連接到載體pGEX-4T-1上構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒，并成功在大腸桿菌BL21中獲得了表達(dá);表達(dá)產(chǎn)物通過(guò) SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示在分子量為63KD處出現(xiàn)蛋白條帶，與目的融合蛋白GST-MIC1分子量大小相符。
　　 3.多克隆抗體的制備及純化
　　 將純化后的融合蛋白GST-MIC1作為免疫原，免疫家兔，成功制備了兔抗牛MIC1高免血清，采用間接ELISA法

6、檢測(cè)血清抗體效價(jià)高達(dá)1∶64000，并采用親和層析法對(duì)所獲得的高免血清進(jìn)行了純化。
　　 4.應(yīng)用Western blot的方法檢測(cè)奶牛子宮上皮細(xì)胞在IFN-τ作用下的差異性表達(dá)
　　 利用制備的兔抗奶牛MIC1高免血清，采用Western blot方法檢測(cè)IFN-τ在不同濃度及作用時(shí)間下對(duì)奶牛子宮上皮細(xì)胞MIC1蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，不同濃度、時(shí)間IFN-τ對(duì)奶牛子宮上皮細(xì)胞MIC1蛋白表達(dá)有所不同，且IFN-τ下

7、調(diào)MIC1蛋白在奶牛子宮上皮細(xì)胞上的表達(dá)。
　　 5.應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)奶牛主要組織中的表達(dá)與分布
　　 利用純化的兔抗奶牛多克隆抗體建立了奶牛肝臟、脾臟、子宮、卵巢MIC1蛋白表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，MIC1蛋白在肝臟和脾臟中表達(dá)呈弱陽(yáng)性，在卵巢和子宮中表達(dá)陽(yáng)性率極高，尤在上皮組織中的表達(dá)量最高，說(shuō)明MIC1表達(dá)具有選擇性。
　　 結(jié)論:應(yīng)用基因克隆表達(dá)技術(shù)和抗體制備技術(shù)我們成功地制備了奶牛