紅羅非魚生長相關(guān)TRAP分子標(biāo)記篩選及其遺傳多樣性分析.pdf

1、羅非魚是世界最重要的養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類之一，作為重要的動物性蛋白質(zhì)來源，得到了聯(lián)合國糧農(nóng)組織的大力推薦。中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心2009年從馬來西亞引進(jìn)了紅羅非魚，并進(jìn)行了馴化、擴(kuò)繁和選育。靶位區(qū)域擴(kuò)增多態(tài)性(targetregion amplified polymorphism，TRAP)分子標(biāo)記由于其具有簡單、多態(tài)性豐富、重復(fù)性好、易測序等優(yōu)點得到了分子育種研究者的重視。它是利用已知的EST或者cDNA序列信息和生物信息工具來設(shè)

2、計固定引物，偏向產(chǎn)生緊密連鎖目標(biāo)區(qū)域的多態(tài)性標(biāo)記。已經(jīng)用于植物的遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源分析、重要生長性狀相關(guān)標(biāo)記篩選、遺傳圖譜構(gòu)建以及分子標(biāo)記輔助育種等。該研究將使用TRAP標(biāo)記分析紅羅非魚遺傳結(jié)構(gòu)以及篩選生長性狀相關(guān)的分子標(biāo)記。
　　 首先，該研究對紅羅非魚測量的基本形態(tài)性狀進(jìn)行了初步分析，同時計算出體重、體長、體厚、體高、尾柄長之間的相關(guān)系數(shù)以及形態(tài)性狀對體重的通徑分析，獲得測量的形態(tài)性狀對體重的決定系數(shù)、決定程度。并把三

3、個測得的形態(tài)性狀指標(biāo)作為自變量，體重作為因變量建立了多元回歸方程:Y=-474.877+1.813X1+5.874X2+2.709X3，Y、X1、X2、X3分別表示體重(g)、體長(mm)、體厚(mm)、體高(mm)。
　　 其次，為了獲得穩(wěn)定性好、重復(fù)性強(qiáng)的羅非魚TRAP反應(yīng)體系，本首次綜合運(yùn)用L16(45)正交和單因素方法優(yōu)化羅非魚TRAP反應(yīng)體系。兩種分析方法結(jié)果中dNTPs濃度、隨機(jī)引物濃度、DNA濃度相同而Mg2+濃度

4、和Taq聚合酶濃度不同，不同因素間存在一定的交互作用。正交設(shè)計法比單因素法更簡單、科學(xué)、合理。本實驗獲得羅非魚15μLTRAP最優(yōu)反應(yīng)體系:DNA模板濃度為60ng、Mg2+濃度為1.5mmol/L、dNTPs濃度為0.3mmol/L、Taq聚合酶0.5U、隨機(jī)引物濃度為7pmol/L、固定引物濃度為10pmol/L。擴(kuò)增程序為:94℃2min;94℃45s，38℃45s，72℃1min，5個循環(huán):94℃45s，53℃45s，72℃1m

5、in，35個循環(huán);72℃延伸8min。該反應(yīng)體系在4個羅非魚群體中驗證，并用10對多態(tài)性好的TRAP標(biāo)記分析吉富羅非魚的遺傳多樣性，表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。該反應(yīng)體系的建立為TRAP標(biāo)記應(yīng)用于羅非魚遺傳多樣性評價、種質(zhì)鑒定、分子標(biāo)記輔助育種等研究提供了新的手段。
　　 再者，為了獲得與紅羅非魚生長性狀相關(guān)的TRAP分子標(biāo)記，該研究使用最后優(yōu)化后的反應(yīng)體系，采用15對多態(tài)性好的TRAP標(biāo)記分析同池的紅羅非魚的遺傳多樣性，并運(yùn)用

6、t檢驗篩選生長性狀（體重、體高、尾柄長）相關(guān)的分子標(biāo)記。結(jié)果表明，15對TRAP引物擴(kuò)增出251個位點，多態(tài)性位點216個，平均多態(tài)性位點比例為86％。該研究群體PIC平均值為0.21，Shannon信息指數(shù)平均為0.466，Nei's遺傳多樣指數(shù)平均為0.316，表明該群體遺傳多樣性豐富。初步篩選出TRAP位點gh1-Trap1380005與體重和體高呈極顯著相關(guān)（P＜0.01），gh1-Em110與尾柄長和體重呈極顯著相關(guān)。紅羅非魚