泥鰍養(yǎng)殖水體中芽孢桿菌的篩選、生長特性及其應(yīng)用效果研究.pdf

1、氨氮、亞硝態(tài)氮的積累和有機(jī)物污染是泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)池塘養(yǎng)殖水體惡化，病害頻發(fā)及品質(zhì)下降的主要原因。利用水中有益微生物對已污染的養(yǎng)殖水環(huán)境進(jìn)行生物修復(fù)是目前研究與開發(fā)的熱點(diǎn)，而通過篩選獲得凈水效果和制劑生產(chǎn)性能優(yōu)良的優(yōu)勢菌株是研發(fā)高效微生態(tài)制劑的關(guān)鍵。目前水產(chǎn)養(yǎng)殖用益生菌制劑很多，但針對泥鰍使用的益生菌的篩選、生長特性及應(yīng)用研究則未見報(bào)道。本研究從泥鰍養(yǎng)殖池塘水中分離篩選出1株益生枯草芽孢桿菌(

2、NQ1)，考察了NQ1的生長特性、培養(yǎng)特性、安全性、水質(zhì)凈化效果以及對泥鰍免疫功能影響，試驗(yàn)結(jié)果可為在泥鰍養(yǎng)殖中推廣應(yīng)用提供依據(jù)。研究獲得的具體結(jié)果如下：
　　1．泥鰍養(yǎng)殖水體中益生芽孢桿菌的篩選
　　從泥鰍養(yǎng)殖池塘水樣中分離純化得到4株芽孢桿菌，經(jīng)過降解氨氮、亞硝態(tài)氮能力篩選試驗(yàn)，獲得1株優(yōu)勢目的菌株，命名為NQ1。在模擬淡水中，在氨氮、亞硝態(tài)氮初始濃度分別為5 mg/L和2 mg/L時(shí)，2 d后菌株NQ1對氨氮的降解率為

3、33.5％，對亞硝態(tài)氮的降解率為99.2%。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和生理生化特性結(jié)果，將其初步鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。經(jīng)生長特性研究表明，枯草芽孢桿菌NQ1可在培養(yǎng)6 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，在培養(yǎng)16 h后即達(dá)到穩(wěn)定生長階段；同時(shí)對溫度、鹽度、pH都具有較好的適應(yīng)性。安全性試驗(yàn)證實(shí)，試驗(yàn)濃度(最高為1×107 cfu/mL)的枯草芽孢桿菌NQ1對泥鰍安全。此外，將1×107 cfu/mL的NQ1與1×107 cf

4、u/mL的嗜水氣單胞菌混合添加至養(yǎng)殖水體中，以空白組為陰性對照組，以添加1×107 cfu/mL嗜水氣單胞菌的試驗(yàn)組為陽性對照組，暫養(yǎng)泥鰍14 d，結(jié)果顯示，NQ1與嗜水氣單胞菌混合添加組的泥鰍存活率較陽性對照組高25%。
　　2．枯草芽孢桿菌NQ1的生長特性及培養(yǎng)基的優(yōu)化
　　以普通牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為初始培養(yǎng)基，研究了不同培養(yǎng)時(shí)間、初始pH值、溫度、鹽度(NaCl濃度)、轉(zhuǎn)速、裝液量和接種量對芽孢桿菌NQ1生長的影響，

5、結(jié)果表明：菌株NQ1最大活菌數(shù)的培養(yǎng)條件為發(fā)酵時(shí)間20 h，初始pH7.4，溫度為28℃，鹽度為0.5%(w/v)，轉(zhuǎn)速為180 r/min，裝液量為80 mL/250 mL，接種量為10%。采用單因子試驗(yàn)和L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化了種子培養(yǎng)基的組成，結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)條件下的最佳種子培養(yǎng)基為：蛋白胨為(2%)(w/v)、葡萄糖為(2%)(w/v)、NaCl為(0.3%)(w/v)，三種成份對NQ1菌株產(chǎn)活菌數(shù)影響力大小順序?yàn)榈鞍纂?、NaC

6、l、葡萄糖。以上述最佳種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，NQ1菌株產(chǎn)活菌數(shù)達(dá)10.44×108 cfu/mL。
　　3．枯草芽孢桿菌NQ1對泥鰍養(yǎng)殖水質(zhì)的影響
　　以0、1×105、1×106和1×107cfu/mL的濃度將枯草芽孢桿菌NQ1添加至養(yǎng)殖水體中，考察NQ1對泥鰍水質(zhì)指標(biāo)的影響。結(jié)果表明，NQ1使用14 d后，1×107 cfu/mL濃度組的氨氮降解率(52.67%)、亞硝態(tài)氮降解率(50.18%)和硫化物降解率(48%)均為3個(gè)

7、試驗(yàn)組中的最高值，而且pH波動(dòng)最小(7.76～7.65)。由此表明，1×107 cfu/mL的枯草芽孢桿菌NQ1對凈化泥鰍養(yǎng)殖池塘水質(zhì)具有明顯的作用。
　　4．枯草芽孢桿菌NQ1對泥鰍消化酶活性及非特異性免疫的影響
　　以0(對照)、1×105(低濃度)、1×106(中低濃度)和1×107cfu/mL(高濃度)的劑量將枯草芽孢桿菌NQ1添加至養(yǎng)殖水體中，考察NQ1對泥鰍消化酶活性及非特異性免疫的影響。結(jié)果表明：14 d時(shí)，與

8、對照組相比，高濃度組和中濃度組可顯著提高腸道淀粉酶(AMS)和腸道脂肪酶活性(LPS)(P<0.05)，高濃度組好于中濃度組，但差異不顯著(P>0.05)，低濃度組對泥鰍腸道的AMS與LPS活性無顯著影響(P>0.05)，表明NQ1菌株對泥鰍腸道消化酶活性具有較好的促進(jìn)作用。與此同時(shí)，與對照組相比，中、高濃度組的紅細(xì)胞數(shù)(RBC)、白細(xì)胞數(shù)(WBC)、血液白細(xì)胞的吞噬百分率(PP)、吞噬指數(shù)(PI)，肝臟溶菌酶(LSZ)、酸性磷酸酶(A

9、CP)、堿性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)活性及總抗氧化能力(T-AOC)均顯著高于對照組(P<0.05)，對肝臟谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)活性無顯著影響(P>0.05)。從總體上看，高濃度的效果優(yōu)于中濃度。因此，在水體中添加1×107 cfu/mL的枯草芽孢桿菌NQ1能明顯促進(jìn)養(yǎng)殖泥鰍的消化酶活性和非特異性免疫機(jī)能。
　　綜上所述，枯草芽孢桿菌NQ1具備作為益生菌開發(fā)應(yīng)用的潛力。