代爾夫特菌MTQ3拮抗相關(guān)基因tetR的克隆及功能驗(yàn)證.pdf

1、以煙草青枯病病原菌-青枯假單胞菌為靶標(biāo)菌，利用平板對(duì)峙法，篩選獲得2株具有較強(qiáng)且穩(wěn)定拮抗能力的拮抗菌，編號(hào)分別為MTQ3、FGQ5。以16SrRNA基因分子鑒定方法為主要依據(jù)，結(jié)合菌株的形態(tài)、生理生化特征對(duì)拮抗菌株進(jìn)行鑒定。經(jīng)鑒定，MTQ3為Delftiatsuruhatensis，F(xiàn)GQ5為食酸代爾夫特菌Delftia acidovorans，將16S rRNA基因序列提交GenBank，登錄號(hào)為MTQ3：HQ327477，F(xiàn)GQ5：

2、HQ327476。
　　 用抗生素梯度平板法，對(duì)MTQ3和FGQ5進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。結(jié)果表明，MTQ3、FGQ5均為卡那霉素敏感，能耐受10μg/mL的利福平。分別以MTQ3、FGQ5為受體菌，以E.coliDH5ct(pRL1063a)為供體菌，E.coliDH5α(pRK2013)為輔助菌，進(jìn)行三親本雜交，得到8896個(gè)接合子，建立了Tn5隨機(jī)插入突變庫(kù)。采用影印法對(duì)突變株進(jìn)行拮抗性能檢測(cè)，從MTQ3的突變庫(kù)中篩選到23個(gè)抑菌圈

3、變大的突變株，4個(gè)抑菌圈變小的突變株，1個(gè)拮抗能力完全消失的突變株(MTQ3-△T)；從FGQ5的突變庫(kù)中篩選到12個(gè)抑菌圈變大的突變株，5個(gè)抑菌圈變小的突變株。根據(jù)轉(zhuǎn)座子Tn5-1063上的luxA序列設(shè)計(jì)引物，以轉(zhuǎn)座子插入突變株總DNA為模板，PCR擴(kuò)增luxA序列。結(jié)果證實(shí)，Tn5-1063插入到拮抗菌基因組中。對(duì)MTQ3-△T進(jìn)行16SrDNA測(cè)序驗(yàn)證，其序列與MTQ3的16SrDNA序列完全一致。
　　 從Tn5-10

4、63左末端向上游設(shè)計(jì)3個(gè)嵌套引物，同時(shí)設(shè)計(jì)了7個(gè)隨機(jī)兼并引物，用TAIL-PCR(Thermal asymmetric inter laced PCR)方法，從突變株MTQ3-△T中克隆獲得了轉(zhuǎn)座子左側(cè)翼序列，經(jīng)比對(duì)為tetR基因的下游序列。以得到的序列設(shè)計(jì)特異性引物，繼續(xù)進(jìn)行TAIL-PCR擴(kuò)增，拼接得到1492bp的片段，包含tetR基因的完整序列。將序列提交GenBank，獲得登錄號(hào)JQ425693。本實(shí)驗(yàn)所得到的tetR基因全長(zhǎng)

5、666bp，產(chǎn)物為含有223個(gè)氨基酸的TetR蛋白，屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)控TetR家族。其與已知基因組全序列的Delftia acidovorans SPH-1及Delftia sp.Cs1-4中tetR基因的相似性均為93％，蛋白序列相似性分別為95％和96％。
　　 為了驗(yàn)證tetR基因?qū)TQ3拮抗作用的影響，本工作構(gòu)建了tetR的互補(bǔ)菌株。選擇具有四環(huán)素抗性的pBR322質(zhì)粒作為載體，克隆包含完整tetR基因及其啟動(dòng)子區(qū)的1278

6、bp片段，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pBR322-T。通過(guò)三親本雜交，分別將pBR322和pBR322-T導(dǎo)入突變株MTQ3-△T，獲得重組菌株MTQ3-△T-P和MTQ3-T。采用對(duì)峙平板法，檢測(cè)MTQ3、MTQ3-△T、MTQ3-△T-P及MTQ3-T的拮抗能力，進(jìn)行基因功能互補(bǔ)驗(yàn)證。結(jié)果表明，MTQ3-T完全恢復(fù)了拮抗能力，證實(shí)了tetR基因與MTQ3的拮抗性能有關(guān)。雖然Delftia acidovorans SPH-1及Delfita sp