APEC tmRNA-SmpB系統(tǒng)、neuC和ompT突變株的構(gòu)建及抗性去除與否對(duì)致病性的影響.pdf

1、大腸桿菌是寄居在人和溫血?jiǎng)游锬c道中的正常菌群之一，大部分為非致病性菌株，然而少數(shù)具有致病性。致病性大腸桿菌可分為兩大類:腸道致病性大腸桿菌和腸道外致病性大腸桿菌(ExPEC)。禽致病性大腸桿菌(avian pathogenic E.coli，APEC)屬于ExPEC的成員，定植于腸道外，能夠引起禽的局部或全身感染性疾病-大腸桿菌病。禽大腸桿菌病已成為最嚴(yán)重的細(xì)菌性傳染病之一，給全世界養(yǎng)禽業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。已發(fā)現(xiàn)APEC具有多種致病

2、因子，且新的致病因子在不斷地被研究發(fā)現(xiàn)?；蛲蛔兊姆椒ㄊ茄芯炕蚬δ艿闹饕侄?。λRed重組系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于大腸桿菌基因突變株的構(gòu)建，該系統(tǒng)的簡(jiǎn)便、高效為我們研究APEC目標(biāo)基因提供了方便。
　　本研究運(yùn)用λRed重組系統(tǒng)構(gòu)建了APEC優(yōu)勢(shì)血清型O2 E058菌株GI22基因組島、tmRNA-SmpB系統(tǒng)、neuC和ompT基因缺失突變株，探討其與致病性之間的關(guān)系，進(jìn)而對(duì)突變株抗性去除前后致病作用改變的分子機(jī)制進(jìn)行探討，旨在了解禽致

3、病性大腸桿菌的致病機(jī)制及加深對(duì)λRed重組系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)，為深入研究APEC的致病機(jī)理及評(píng)價(jià)潛在致病基因的致病力奠定基礎(chǔ)。
　　1.運(yùn)用λRed重組系統(tǒng)構(gòu)建APEC tmRNA-SmpB系統(tǒng)突變株及其致病性分析
　　以高致病株APEC O2 E058為研究對(duì)象，通過基因克隆、測(cè)序、比對(duì)的方法，確定GI22基因組島存在于APEC E058株中，并對(duì)GI22基因組島進(jìn)行序列分析和定位。進(jìn)而，運(yùn)用λRed重組的方法成功構(gòu)建了GI22全

4、基因組島突變株E058△GI22-I。1日齡SPF仔雞及35日齡SPF雞體內(nèi)定植與持續(xù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，突變株較野生株的致病力顯著降低。相關(guān)的研究結(jié)果及進(jìn)一步研究表明，ssrA是GI22基因組島的整合位點(diǎn)，ssrA和其鄰近基因smpB組成tmRNA-SmpB系統(tǒng)，該系統(tǒng)或許與E058△GI22-I基因組島突變株致病力降低有關(guān)。
　　運(yùn)用λRed重組系統(tǒng)，成功構(gòu)建了APEC E058△smpB，E058△ssrA和E058△smpB△s

5、srA基因缺失突變株，同時(shí)構(gòu)建了雙基因突變株的回復(fù)株ReE058△smpB△ssrA。SPF雞致死性試驗(yàn)及定植與持續(xù)性感染試驗(yàn)結(jié)果均表明，破壞smpB或ssrA和同時(shí)破壞這兩個(gè)基因，均可以顯著降低APEC E058的致病力，且回復(fù)株的致病力能夠得到顯著回復(fù)。雞巨噬細(xì)胞HD-11感染試驗(yàn)結(jié)果表明，突變株在HD11內(nèi)增殖和/或存活的能力降低。組織病理學(xué)結(jié)果表明，野生株感染組雞的臟器病變程度較E058△smpB，E058△ssrA及雙基因突變

6、株感染組更為嚴(yán)重，而回復(fù)株感染組雞的臟器病變程度與野生株感染組相似。同時(shí)，熒光定量PCR試驗(yàn)結(jié)果顯示，E058△smpB△ssrA突變株中轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因rfaH，毒力基因kpsM、chuA和iss的表達(dá)水平較野生株顯著下調(diào)。然而，體外試驗(yàn)結(jié)果顯示，突變株與野生株在抵抗SPF雞血清補(bǔ)體殺菌、HD-11細(xì)胞吞噬、及在37℃和42℃的LB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況等方面均沒有顯著差異。這些數(shù)據(jù)表明，tmRNA-SmpB系統(tǒng)對(duì)APEC O2 E058株的

7、致病性是至關(guān)重要的。
　　2.λRed重組系統(tǒng)引入抗性去除前后APEC tmRNA-SmpB系統(tǒng)，neuC和ompT突變株致病作用的研究
　　λRed重組系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于大腸桿菌基因功能的研究，該系統(tǒng)的簡(jiǎn)便、高效為我們研究APEC的目標(biāo)基因提供了方便。然而，本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，neuC有抗與無抗突變株之間在致病性方面存在差異。針對(duì)這一現(xiàn)象，本研究選取了tmRNA-SmpB系統(tǒng)，neuC和ompT三種不同功能的基因進(jìn)行了進(jìn)一步的研

8、究。
　　本研究中，我們將E058△ssrA、E058△smpB△ssrA、E058△tmRNA-SmpB、E058△neuC和E058△ompT突變株中的cat抗性去除，RT-PCR試驗(yàn)結(jié)果顯示，所有有抗突變株中原基因與cat抗性之間形成的重組片段均不能正常轉(zhuǎn)錄，而抗性去除后產(chǎn)生的重組片段ssrA'、tmRNA-SmpB'、neuC'和omp T均可正常轉(zhuǎn)錄。且無抗突變株E058△smpB△ssrA中產(chǎn)生的smpB-kan片段依

9、然不能正常轉(zhuǎn)錄。1日齡SPF雞致死性試驗(yàn)及35日齡SPF雞體內(nèi)定植與持續(xù)試驗(yàn)結(jié)果均表明，tmRNA-SmpB系統(tǒng)無抗突變株較其有抗突變株相比，致病力沒有表現(xiàn)出顯著差異。
　　1日齡SPF雞致死性試驗(yàn)及35日齡SPF雞體內(nèi)定植與持續(xù)試驗(yàn)結(jié)果均表明，較野生株E058相比，新突變的E058△neuC有抗突變株致病力極顯著降低，且回復(fù)株ReE058△neuC的致病力能夠得到顯著回復(fù)。同時(shí)，與有抗突變株E058△neuC相比，無抗突變株E0

10、58△neuC'在SPF雞的肝臟、脾臟、肺臟和腎臟中的定植及感染能力增強(qiáng)。體內(nèi)定植與持續(xù)試驗(yàn)結(jié)果表明，較野生株相比，ompT基因突變株的定植能力顯著降低，且回復(fù)株ReE058△ompT的致病力與野生株相當(dāng)。SPF雞感染模型表明，在感染雞的各個(gè)臟器中，無抗突變株E058△ompT'的致病力較有抗突變株E058△ompT極顯著放大。
　　以上研究結(jié)果表明，tmRNA-SmpB系統(tǒng)，neuC和ompT基因均與APEC E058株的致病性

11、高度相關(guān)。同時(shí)，運(yùn)用λRed重組系統(tǒng)構(gòu)建的有抗突變株，其抗性的去除與否對(duì)APEC突變株的致病性評(píng)價(jià)產(chǎn)生影響。
　　3.APEC neuC和ompT突變株抗性去除后致病作用改變的初步機(jī)制研究
　　根據(jù)第二章內(nèi)容，我們得出運(yùn)用λRed重組系統(tǒng)構(gòu)建的neuC和ompT突變株，在其抗性去除之后相對(duì)有抗突變株致病性增強(qiáng)。本研究對(duì)突變株抗性去除后致病作用改變的分子機(jī)制進(jìn)行探討。氨基酸序列比對(duì)及編碼框預(yù)測(cè)結(jié)果表明，neuC'和omp T'

12、錄本中，除殘余的neuC和ompT同源臂片段編碼的氨基酸與目標(biāo)基因的氨基酸100％同源外，未發(fā)現(xiàn)抗性去除后引入的外源片段與已知基因間有同源性，且殘留的neuC和ompT同源臂片段與抗性去除后引入的外源片段的部分序列之間可以形成有意義的編碼框。
　　根據(jù)預(yù)測(cè)分析結(jié)果，首先，我們對(duì)neuC'轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了蛋白表達(dá)。SDS-PAGE結(jié)果顯示，表達(dá)出了符合預(yù)測(cè)結(jié)果大小的蛋白。其次，我們對(duì)無抗突變株中的neuC'轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了上中下分段突變，通

13、過SPF雞感染模型評(píng)價(jià)分段突變株與無抗突變株E058△neuC'間致病性的關(guān)系。結(jié)果表明，與無抗突變株E058△neuC相比，neuC'上段突變株E058△neuC'up∷kan在脾臟和肺臟的定植能力顯著降低;中段突變株E058△neuC'middle∷kan在肺臟的定植能力顯著降低;下段突變株E058△neuC'down∷kan在被檢測(cè)SPF雞的所有臟器中都沒有表現(xiàn)出顯著差異。這一結(jié)果表明，無抗突變株E058△neuC'的致病性與ne

14、uC'轉(zhuǎn)錄本的上段與中段序列有關(guān)，與下段序列無關(guān)。以上結(jié)果提示我們，無抗突變株致病作用的放大或許和原基因殘留的同源臂片段有關(guān)。
　　根據(jù)預(yù)測(cè)分析結(jié)果，同時(shí)構(gòu)建了缺失ompT ORF不同大小片段的有抗與無抗突變株，運(yùn)用SPF雞感染模型對(duì)有抗與無抗突變株的致病力進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，缺失掉ompT整個(gè)的ORF大小及1/2的ORF大小，有抗突變株的體內(nèi)定植能力均顯著下降，其無抗突變株與有抗突變株相比，在SPF雞體內(nèi)的定植能力均沒有明顯差