雞白介素18成熟蛋白的發(fā)酵工藝及其對(duì)新城疫疫苗免疫增強(qiáng)作用研究.pdf

1、雞白介素18(Chickeninterleukin-18，ChIL-18)是2000年發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子，它具有廣泛的生物學(xué)活性，除能夠促進(jìn)γ-干擾素(IFN-γ)的產(chǎn)生，刺激淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷活性，還在介導(dǎo)細(xì)胞免疫、抵抗微生物感染方面具有重要的作用。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前最為成功的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一，該系統(tǒng)操控簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，表達(dá)量高，具有翻譯后修飾的能力。目前已有多種外源蛋白在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中得到成功表達(dá)。因此可用畢赤

2、酵母表達(dá)獲得高產(chǎn)量且具有生物活性的雞白介素18成熟蛋白(matureChickeninterleukin-18，mChIL-18)。本試驗(yàn)我們對(duì)表達(dá)重組雞白介素18(mChIL-18)的畢赤酵母工程菌株GS115/pPIC9K-mChIL-18進(jìn)行中試發(fā)酵表達(dá)，優(yōu)化各種發(fā)酵條件以提高表達(dá)產(chǎn)量。然后將mChIL-18制備成脂質(zhì)體制劑以提高其生物利用度，測(cè)定其對(duì)新城疫疫苗的免疫增強(qiáng)作用，為mChIL-18的研究與開發(fā)打下基礎(chǔ)。本研究的主要結(jié)

3、果如下：
　　 復(fù)蘇工程菌GS115/pPIC9K-mChIL-18于YPD培養(yǎng)基，在其OD600達(dá)到5.2左右時(shí)轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中，采用分批補(bǔ)料方式對(duì)畢赤酵母工程菌進(jìn)行高密度發(fā)酵?？刂坪蛢?yōu)化各種發(fā)酵條件，經(jīng)歷84h結(jié)束發(fā)酵。將發(fā)酵液離心，用6×His鎳柱對(duì)上清中的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化。經(jīng)優(yōu)化表達(dá)條件，證明在pH5.5，溶氧值20％-30％，溫度28℃，誘導(dǎo)72h，mChIL-18的表達(dá)產(chǎn)量為560mg/L，發(fā)酵上清經(jīng)純化后純度可達(dá)70％

4、以上。
　　 用逆向蒸發(fā)法制備半胱胺脂質(zhì)體將mChIL-18與膽固醇和磷酸卵磷脂按照一定的比例減壓蒸餾制成，包封率為25.4％。
　　 同時(shí)，針對(duì)IL-18具有免疫治療及免疫增強(qiáng)作用這一功能，將SPF雞隨機(jī)分成4組，Ⅰ組為單純疫苗組；Ⅱ組為聯(lián)合免疫組，每組注射0.2mLmChIL-18脂質(zhì)體；Ⅲ組為空載體免疫組；Ⅳ組為空白對(duì)照組，只注射生理鹽水。7日齡首免，從體液免疫和細(xì)胞免疫水平上分析試驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果表明，mChIL-1

5、8脂質(zhì)體與疫苗聯(lián)合接種試驗(yàn)雞所產(chǎn)生的HI抗體在接種14d后一直高于單純疫苗免疫組，且在接種后第14、21和28天時(shí)差異顯著(P<0.05)；同時(shí)，流氏細(xì)胞術(shù)檢測(cè)試驗(yàn)雞CD4+和CD8+T細(xì)胞增殖試驗(yàn)表明，接種mChIL-18脂質(zhì)體的試驗(yàn)雞CD4+和CD8+T細(xì)胞增殖反應(yīng)均強(qiáng)于單純疫苗免疫組。其中，CD4+和CD8+T細(xì)胞都呈上升趨勢(shì)，但一免的7d后呈下降趨勢(shì)，在二免后又呈上升趨勢(shì)且持續(xù)時(shí)間比較長(zhǎng)，在各階段與其它組差異顯著(P<0.05)