基于磁珠—酶放大免疫熒光方法檢測豬胸膜肺炎放線桿菌感染血清中ApxIVA抗體.pdf

1、豬傳染性胸膜肺炎(Porcine Contagious pleuropneumonia)是由豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的，屬于豬三大呼吸道傳染病之一，在世界絕大部分國家和地區(qū)均有爆發(fā)，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬場一旦感染該病其急性致死率高達(dá)80%以上，而轉(zhuǎn)變成慢性感染后會嚴(yán)重影響豬的生長，且存活下來的豬會成為病原攜帶者，在適當(dāng)?shù)臈l件下將能使該病再次爆發(fā)。因此，為

2、了有效的防疫和控制該疾病的爆發(fā)，對該病的檢測，特別是早期診斷具有重要的意義。目前，使用最為廣泛的診斷手段是利用間接ELISA技術(shù)對APP感染豬血清中的抗體進(jìn)行檢測。雖然該方法具有易于操作、特異性好等優(yōu)勢，但是其靈敏度低、耗時(shí)長等不足嚴(yán)重制約了其在臨床上的應(yīng)用。所以，建立新型的快速、高靈敏度的檢測方法具有現(xiàn)實(shí)意義。
　　 磁性微粒，簡稱磁珠自上世紀(jì)70年代以來得到了廣泛的研究，因?yàn)槠渚哂辛叫?10 nm-100μm)、比表面積大

3、、生物親和性好以及超順磁性和分散性好等特點(diǎn)而被作為一種有效的固相載體用在免疫診斷、生物分子純化和細(xì)胞分離等生物領(lǐng)域中。用于免疫診斷中，因?yàn)榇胖椴东@抗體(抗原)分子能力強(qiáng)，且在三維空間進(jìn)行免疫反應(yīng)，所以利用磁珠作為載體進(jìn)行疾病的免疫檢測具有靈敏度好、檢測時(shí)間快、易于操作和檢測成本低等特點(diǎn)使其具有巨大的應(yīng)用價(jià)值而得到研究者的重視。
　　 本實(shí)驗(yàn)以磁珠為固相載體，以大腸桿菌原核重組表達(dá)的APP特異性的外毒素蛋白ApxIVA作為抗原，構(gòu)

4、建了一種簡單、低成本且易于操作的基于磁珠-酶放大的熒光免疫方法檢測APP感染血清中的ApxIVA抗體。其具體方法為：首先將ApxIVA抗原蛋白固定在磁珠表面，依次加入感染血清進(jìn)行第一次免疫反應(yīng)，加入酶標(biāo)二抗進(jìn)行第二次免疫反應(yīng)。HRP可以催化底物對羥基苯乙酸產(chǎn)生具有熒光信號的聯(lián)苯乙酸，而感染APP血清中的ApxIVA抗體就可以通過測定聯(lián)苯乙酸的強(qiáng)度而進(jìn)行檢測。在最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件下，我們得到了很好的線性，即在160-5120倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)陽性范

5、圍內(nèi)成線性。該方法的檢測線是10240倍稀釋血清，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)的ApxIVA-ELISA方法的檢測線(320倍)(S/N=3)。同時(shí)，我們測定了11組320倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，計(jì)算它們的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.8%。這說明我們提供的方法具有很好的重復(fù)性。同時(shí)，與商用ApxIVA-ELISA試劑盒共同分析了78份臨床豬血清，其結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)兩種方法具有89.7%的符合率、90.9%的敏感性和89.3%的特異性。這說明我們構(gòu)建的方法具有應(yīng)用于臨床