鹿重組PrPc蛋白單克隆抗體的制備及CWD免疫組織化學(xué)檢測(cè)方法的建立.pdf

1、PreparationofMonoclonalAntibodyagainstPrPcandDevelopmentofIHCforCWDResistin，t‘11hcsIssubmittedtoQingdaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeof—MasterofAgronomyZhangXinxin(CollegeofAnimalSciencea

2、ndVeterinaryMedicine)Supervisor：LiuHuanqiQingdaoChinaJune，2012鹿重組PrPc蛋白單克隆抗體的制備及CWD免疫組織化學(xué)檢測(cè)方法的建立摘要傳染性海綿狀腦病(TransmissiblespongiformcncephalopathyTSE)是一種重要的人畜共患病，主要的感染動(dòng)物包括羊、牛、水貂及一些鹿科動(dòng)物。鹿的TSE稱(chēng)為鹿慢性消耗性疾病(ChronicWastingDisease

3、，CWD)。TSE的病原是一種由體內(nèi)正常的朊蛋白(PrPc)轉(zhuǎn)化成的朊毒體(PrPsc)。目前檢測(cè)該病較為有效的方法是免疫組化，組織切片經(jīng)蛋白酶K消化后，PrPc被完全消化，而prpsc的核心片段能抵抗蛋白酶K消化保留了下來(lái)，由于PrPc和PrPsc的一級(jí)結(jié)構(gòu)相同，制備PrPc核心片段的單抗就可以用于CWD的免疫學(xué)檢測(cè)。本試驗(yàn)在已經(jīng)獲得prpc陽(yáng)性重組質(zhì)粒EPrPpET32a()的基礎(chǔ)上，將其轉(zhuǎn)化EcoliBL21(DE3)，挑取陽(yáng)性克

4、隆培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)后裂解茵體作SDSPAGE分析，出現(xiàn)大小約2730KD的表達(dá)產(chǎn)物。重組蛋白純化后經(jīng)Westernblotting分析，表明該蛋白具有較好的反應(yīng)原性。通過(guò)摸索不同誘導(dǎo)時(shí)問(wèn)、溫度和不同IPTG濃度優(yōu)化了重組蛋白的表達(dá)條件：用含100mM氨芐的LB培養(yǎng)基在37“C振搖培養(yǎng)，待茵生長(zhǎng)至OD值06時(shí)，用終濃度為10mM的IPTG誘導(dǎo)，于37℃振蕩培養(yǎng)6h。EcoliBL21(DE3)表達(dá)菌超聲波裂解離心后，上清和沉淀電泳，結(jié)果

5、表明，蛋白幾乎全部存在于包涵體內(nèi)。經(jīng)超聲波裂解茵體后，分離包涵體并離心、洗滌，再用8M尿素溶解包涵體，最后用試劑盒純化經(jīng)變性處理的融合蛋白。以原核表達(dá)并純化的PrPc重組蛋白為免疫原，按常規(guī)方法免疫PrPc基因敲除小鼠，細(xì)胞融合前經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，確定了間接ELISA篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的最佳反應(yīng)條件。即：表達(dá)的抗原用PBS以1：1000倍稀釋?zhuān)?：1000稀釋的陰、陽(yáng)性血清分別作為陰、陽(yáng)性對(duì)照，反應(yīng)條件均為37℃、60rain。取免疫后的