患病羅氏沼蝦幼體可疑病原核酸隨機(jī)克隆技術(shù)的探索.pdf

1、羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii),屬長(zhǎng)臂蝦科(Palaemonidae)、沼蝦屬(Macrobrachium),亦稱白腳蝦、馬來(lái)西亞大蝦、金錢(qián)蝦、萬(wàn)氏對(duì)蝦等,原產(chǎn)于印度太平洋地區(qū),生活在各種類型的淡水或咸淡水水域,1976年由日本引進(jìn)我國(guó),是目前世界上養(yǎng)殖量最高的三大蝦種之一,也是我國(guó)淡水甲殼類的主要養(yǎng)殖品種。但近些年,隨著羅氏沼蝦養(yǎng)殖面積的持續(xù)擴(kuò)大,集約化程度的不斷提高,病毒病也隨之頻發(fā),給羅氏沼蝦養(yǎng)殖帶

2、來(lái)了極大的威脅。到目前為止,報(bào)道過(guò)的感染羅氏沼蝦的病毒有四種即白斑綜合征病毒(WSSV),羅氏沼蝦野田村病毒(Macrobrachium Rosenbergii Nodavirus,MrNV),可能作為 MrNV衛(wèi)星病毒或輔助病毒的極小病毒(extra small virus-like particles，XSV),以及一種比較罕見(jiàn)的能感染羅氏沼蝦肝胰腺上皮細(xì)胞的細(xì)小病毒樣病毒(parvo-like virus)。
　　2011年

3、3月于浙江某羅氏沼蝦育苗場(chǎng)采集了一批患病的羅氏沼蝦幼體樣本,經(jīng)勻漿、0.45微米濾膜過(guò)濾、差速離心、DNase I和RNase A處理,再提取可疑病毒核酸,用多重隨機(jī) PCR和序列非依賴的單引物擴(kuò)增(Sequence independent single primer amplification，SISPA)兩種隨機(jī)克隆技術(shù)分別對(duì)采集的患病幼體樣本進(jìn)行DNA和RNA的隨即克隆和測(cè)序,用BLASTn進(jìn)行測(cè)序結(jié)果分析,特異性檢測(cè)可疑序列。<

4、br>　　通過(guò)多重隨機(jī) PCR技術(shù)對(duì)可疑 DNA病毒進(jìn)行分析,共得到了22個(gè)測(cè)序結(jié)果,使用NCBI中的BLASTn在 NR庫(kù)中進(jìn)行比對(duì),其中14個(gè)克隆為載體,1個(gè)克隆測(cè)序結(jié)果無(wú)意義,2個(gè)克隆為細(xì)菌,3個(gè)克隆為羅氏沼蝦基因組序列,2個(gè)可疑的低同源性序列,序列最短為45bp,最長(zhǎng)為1135bp,平均長(zhǎng)度為873bp。2個(gè)可疑病毒序列分別長(zhǎng)597bp和1053bp。
　　通過(guò)序列非依賴的單引物擴(kuò)增(SISPA)技術(shù)對(duì)可疑 RNA病毒進(jìn)行

5、分析,共得到48個(gè)可疑 RNA提取物來(lái)源的克隆的插入片段的測(cè)序,測(cè)序得到的序列使用NCBI中的blastn功能,在 NR庫(kù)中進(jìn)行比對(duì),其中7個(gè)克隆為載體,17個(gè)克隆結(jié)果無(wú)意義,10個(gè)克隆為細(xì)菌.5個(gè)克隆為羅氏沼蝦基因組序列或線粒體基因序列,2個(gè)克隆為病毒序列,7個(gè)為低同源性序列。測(cè)得的序列長(zhǎng)度最短為71bp,最長(zhǎng)為1167bp,平均長(zhǎng)度為389bp。在測(cè)序得到的兩段與病毒具有部分同源序列的克隆插入片段序列中,一段長(zhǎng)551bp的克隆插入片

6、段與西番蓮屬萎黃病毒(Passiflora chlorosis virus,PCV)序列有一定同源性,一段長(zhǎng)441bp的克隆插入片段與輪狀病毒(Rotavirus,RV)序列有一定同源性。根據(jù)這兩段克隆插入片段序列設(shè)計(jì)引物對(duì)樣品進(jìn)行特異性鑒定的結(jié)果顯示這些克隆插入片段序列確實(shí)是來(lái)源于采集的羅氏沼蝦幼體樣本。
　　本文使用多重隨機(jī) PCR技術(shù)和序列非依賴的單引物擴(kuò)增技術(shù),對(duì)羅氏沼蝦幼體樣本進(jìn)行分析的結(jié)果說(shuō)明,可以應(yīng)用這兩種隨機(jī)克隆技